深低溫冷凍大鼠肢體缺血再灌注損傷及依達拉奉干預(yù)的實驗研究.pdf

1、我們在對缺血再灌注損傷機制研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合大鼠后肢血管的解剖特點，建立了經(jīng)深低溫凍存大鼠斷肢再植(自體)骨骼肌缺血再灌注損傷模型，可最大限度地減少免疫反應(yīng)等其他因素的干擾，通過檢測有關(guān)生化指標(biāo)以及形態(tài)學(xué)觀察，能更好地研究凍存肢體再植后缺血再灌注損傷的機制及其防治措施，為臨床用藥提供理論依據(jù)。本課題研究內(nèi)容分四個部分： 第一部分：大鼠肢體深低溫冷凍后組織學(xué)的病理變化研究目的：通過本實驗為肢體長期深低溫保存，進而為深低溫冷凍肢體再

2、植成功的可行性研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。 方法：取健康成年雄性Wistar大鼠8只，體重500～600g,將左后肢設(shè)為正常對照組，右后肢設(shè)為冷凍組。用3％戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉(30mg/kg.b.w)。將雙后肢均于膝關(guān)節(jié)上離斷，迅速行右后斷肢深低溫冷凍前處理，程序降溫，再移入液氮保存；實驗時取出斷肢并置于恒溫水浴箱快速復(fù)溫(6 min)，然后分別切取大腿內(nèi)側(cè)皮膚、股血管、股神經(jīng)、腓腸肌等組織塊，制作組織切片，并與左側(cè)后肢各相應(yīng)組織

3、切片作形態(tài)學(xué)對比分析。 結(jié)果 (1)大體形態(tài)觀察：冷凍組肢體各組織塊經(jīng)復(fù)溫后，色澤稍淡，輕度水腫，柔軟度、彈性等與正常對照組比較無明顯差別。 (2)組織學(xué)觀察：冷凍后各組織切片顯示：①皮膚：部分表皮細胞核固縮，角化層部分脫落，真皮水腫。②血管：內(nèi)膜不完整，內(nèi)彈力膜部分?jǐn)嗔?，部分管壁平滑肌細胞核固縮、扭曲，間質(zhì)水腫。③神經(jīng)：神經(jīng)束內(nèi)、神經(jīng)纖維之間明顯水腫。④骨骼肌：部分肌纖維細胞核固縮，間質(zhì)水腫，橫紋模糊。

4、 結(jié)論 (1)經(jīng)灌注冷凍保護液、梯度降溫、深低溫保存的皮膚、血管、神經(jīng)、骨骼肌組織仍能保持一定程度的細胞結(jié)構(gòu)完整性，一旦給予恢復(fù)細胞代謝活動的條件，可望能恢復(fù)其生命活動。 (2)本實驗通過對凍存大鼠肢體各組織的形態(tài)學(xué)觀察，可對凍存后斷肢組織的活性作出初步評估，并能為斷肢的再植成功提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。 第二部分：深低溫保存大鼠肢體骨骼肌再灌注損傷模型的建立及意義 目的：建立一種大鼠肢體深低溫保存、再灌注損傷動物

5、模型，進行深低溫保存斷肢再植后骨骼肌缺血再灌注損傷的研究。 方法 (1)實驗一：取健康成年雄性Wistar大鼠12只，體重500～600g，行腹腔內(nèi)注射麻醉(30mg/kg.b.w)。首先顯露并切取一段長約0.5cm股動靜脈，10％甲醛液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀測股動靜脈管壁結(jié)構(gòu)及其厚度。然后采用經(jīng)胸主動脈乳膠灌注方法，測量大鼠股動、靜脈的外徑及長度，同時觀察其分支、走向及分支間距離，為肢體截肢平面的選擇、斷肢

6、的冷凍處理及再植的順利完成提供理論依據(jù)。 (2)實驗二：取健康成年雄性Wistar大鼠72只，體重500～600g，行腹腔內(nèi)注射麻醉(30mg/kg.b.w)，隨機分為A、B、C、D、E、F六組，每組12只。依照實驗一所提供的有關(guān)數(shù)據(jù)，均自右腹股溝下緣沿股血管走向作切口，顯露股動靜脈及其分支血管，自旋髂淺支下緣平面結(jié)扎股動靜脈，再迅速自此平面離斷肢體；然后將斷肢依不同分組情況作相應(yīng)處理后再植于左后肢(將右斷肢皮膚與左側(cè)肢體皮膚縫

7、合固定，右斷肢股動脈直接與左股動脈端端吻合，股靜脈與左股靜脈采用套管法端端吻合)，恢復(fù)肢體血供4 h后取材進行指標(biāo)檢測。正常對照組(A組)：顯露股動靜脈只穿線而不結(jié)扎，直接取材；常溫缺血再灌注組(B組)：將右斷肢在室溫下曠置2.5 h后行再植術(shù)，然后取材；常規(guī)深低溫凍存組(C組)：右側(cè)斷肢經(jīng)深低溫凍存前處理，移入液氮容器內(nèi)保存1個月，實驗時將肢體復(fù)溫、常規(guī)洗脫液灌洗后行斷肢再植(取出斷肢相對應(yīng)大鼠)，然后取材；依達拉奉小、中、大劑量三組

8、(依次設(shè)為D、E、F組)，均經(jīng)深低溫冷凍保存(同C組處理)；實驗時將肢體復(fù)溫，再分別應(yīng)用含低、中、高劑量依達拉奉的洗脫液進行肢體灌洗，再行斷肢再植術(shù)(取出斷肢相對應(yīng)大鼠)，然后恢復(fù)肢體血供4 h后取材。 結(jié)論 (1)制作斷肢模型時，截肢平面應(yīng)選擇在膝最上動脈上至少約6mm處，以盡量多的保留斷肢股動、靜脈長度。 (2)為了使各組熱缺血時間盡量保持一致，可將常溫下缺血再灌注組在室溫下放置約2.5 h后行再植術(shù)。

9、 (3)鑒于股靜脈解剖特點，用套管法吻合股靜脈簡單易行，費時短、通暢率高。 (4)因本實驗?zāi)Ｐ褪潜３种w再灌注4h即可取材，不必行斷肢骨骼內(nèi)固定及肌肉縫合，只需固定斷肢皮緣(皮下組織)即可。 (5)大鼠肢體深低溫凍存再植后缺血再灌注損傷動物模型制作簡單，短時間內(nèi)便于護理，模型穩(wěn)定、安全、實用，是一種研究骨骼肌再灌注損傷的較理想的急性實驗動物模型，由于本模型為自體移植，它排除了免疫排斥反應(yīng)等因素，最大限度地減少了各種

10、干擾因素的影響，能更好的研究深低溫保存骨骼肌再灌注損傷的機制及其保護措施。 第三部分：深低溫保存大鼠肢體骨骼肌再灌注損傷的研究 目的：利用深低溫保存大鼠肢體再灌注損傷動物模型，對常溫下與深低溫凍存肢體再植后骨骼肌缺血再灌注損傷的病理變化進行比較、研究，初步探討深低溫凍存大鼠肢體再灌注損傷的機制，為臨床防治提供理論依據(jù)。 方法：選取健康成年雄性Wistar大鼠36只，體重500～600g，隨機分為三組，每組12只。

11、分別設(shè)為正常對照組(A組)、常溫缺血再灌注組(B組)、常規(guī)深低溫凍存組(C組)。依據(jù)第二部分建立的深低溫凍存大鼠肢體再灌注損傷動物模型，即：A組只顯露右股動、靜脈而不結(jié)扎、離斷肢體，直接取材(取靜脈血和右小腿腓腸肌組織)；B組和C組均自旋髂淺支平面迅速離斷右后肢；其中，對B組斷肢可將其置于室溫2.5h后，再與左股動靜脈吻合，恢復(fù)血供4h后取材(同A組)。對C組，經(jīng)深低溫凍存前處理，最后移入液氮容器中保存；實驗時取出斷肢，快速復(fù)溫，自股動

12、脈插管行洗脫液灌洗，然后再將斷肢股動、靜脈與左后肢股動、靜脈吻合，恢復(fù)血供4h取材(同A組)。對以上三組，均測定每份動物血漿乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)含量，測定骨骼肌組織濕干重比值(W/D)、肌細胞膜Na<'+>-K<'+>-ATP酶和Ca<'+>-ATP酶活性以及骨骼肌丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)活性，觀察骨骼肌的形態(tài)學(xué)改變，以探討常溫缺血再灌注組與常規(guī)深低溫凍存組骨骼肌缺血

13、再灌注損傷程度的差異。 結(jié)論 (1)缺血再灌注損傷是一個多因素參與、多機制損傷的過程，肢體缺血再灌注損傷病理過程涉及肢體及其以外的多個臟器，可以說是整個機體的綜合損傷過程。 (2)深低溫在一定條件下可以保存組織細胞的活性，但同時也會對組織細胞造成不同程度的損傷，當(dāng)凍存斷肢再植后恢復(fù)血供(再灌注)時，肢體會發(fā)生較常溫下更為嚴(yán)重的缺血再灌注損傷?？紤]這可能是在低溫?fù)p傷的基礎(chǔ)上，疊加了缺血再灌注損傷，這種雙重?fù)p傷更易導(dǎo)

14、致血管內(nèi)皮細胞嚴(yán)重受損、使缺血組織(斷肢)中的微血管阻塞，血流減少或阻斷，致使缺血加重，即發(fā)生更為嚴(yán)重的再灌注損傷。但更詳細的發(fā)病機制有待進一步研究。 第四部分：依達拉奉對深低溫保存大鼠肢體骨骼肌再灌注損傷干預(yù)的實驗研究 目的：利用第二部分建立的深低溫凍存大鼠肢體再灌注損傷動物模型，探討凍存肢體再灌注損傷對大鼠骨骼肌細胞膜和骨骼肌線粒體的影響，評價依達拉奉對缺血再灌注損傷骨骼肌細胞膜和線粒體的保護作用及其機制。

15、方法：選取健康成年雄性Wistar-大鼠60只，體重500～600g，隨機分為5組，依次為正常對照組(A組)、常規(guī)深低溫凍存組(C)、依達拉奉小劑量組(D)、依達拉奉中劑量組(E)、依達拉奉大劑量組(F)，每組12只。建立深低溫凍存大鼠肢體再灌注損傷模型。A組僅顯露右股動、靜脈而不結(jié)扎、離斷肢體，直接取材(右側(cè)腓腸肌組織)；C、D、E、F組均自大腿中上段(旋髂淺支下緣平面)離斷右后肢，對斷肢進行深低溫冷凍保存處理并移入液氮容器中凍存；實

16、驗時取出凍存肢體，恒溫水浴箱快速復(fù)溫、灌注洗脫液；其中依達拉奉組(D、E、F組)分別采用含依達拉奉0.1mg/kg.b.w、0.3mg/kg.b.w、0.5mg/kg.b.w的洗脫液進行肢體灌注，然后行自體斷肢再植(取出相對應(yīng)大鼠)，恢復(fù)肢體血供4h后取材(右側(cè)腓腸肌組織)；對以上各組，皆檢測腓腸肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶活性(MPO)、肌細胞膜熒光偏振度(P)和膜Na<'+>-K<'+>-ATP酶、

17、ca<'2+>-ATP酶活性變化，并且提取骨骼肌線粒體，測定線粒體丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、呼吸控制率(RCR)以及光鏡觀察各組骨骼肌組織的結(jié)構(gòu)變化和對骨骼肌超微結(jié)構(gòu)進行透射電鏡檢測。 結(jié)論 (1)經(jīng)深低溫凍存肢體再植前應(yīng)用含依達拉奉洗脫液進行斷肢灌注，可以明顯減輕骨骼肌再灌注損傷，其機理可能是依達拉奉通過清除自由基，抑制了膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對肢體骨骼肌細胞膜及線粒體具有保護作用。(2)對于該藥物用