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文檔簡介
1、表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)屬于受體酪氨酸激酶,在哺乳動物生長發(fā)育過程有重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR通過激活mTOR信號通路調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇的合成,脂肪酸和膽固醇合成相關基因反過來對EGFR也發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。EGFR的研究熱點主要集中在腫瘤癌癥領域,而在脂肪酸代謝領域的研究較少,在反芻動物如奶山羊和奶牛上更是鮮見類似報道。
本研究通過克隆得到了山羊EGFR基因CDs
2、區(qū)序列。原核表達截短型EGFR蛋白,制備了兔抗山羊EGFR多克隆抗體。成功包裝Ad-EGFR重組腺病毒并合成針對EGFR基因的siRNA序列,通過RT-qPCR檢測EGFR基因過表達和干擾后對山羊原代乳腺上皮細胞脂質(zhì)合成相關基因的影響,以期通過本研究為EGFR基因?qū)θ槌煞执x調(diào)控機理的研究奠定理論基礎。獲得的主要研究成果如下:
(1)克隆得到奶山羊EGFR基因CDs區(qū)序列3627bp,編碼1208個氨基酸。EGFR蛋白的第24
3、和25個氨基酸之間為信號肽切割位點,N端區(qū)域具有較強的疏水性,C端具有較強的親水性。奶山羊泌乳前期和泌乳后期EGFR基因的表達量最高,干奶期的表達量最低。
(2)克隆得到截短型EGFR蛋白(ECD),并構建pET-32a(+)-ECD原核表達載體,該載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌后37℃,0.8mmol/L IPTG誘導6h得到重組蛋白,重組蛋白純化效果良好。iELISA檢測發(fā)現(xiàn)抗血清效價高達1∶16000,Western blot
4、檢測呈現(xiàn)較好的抗體特異性。
(3)成功構建并包裝得到重組腺病毒Ad-EGFR,感染山羊原代乳腺上皮細胞36h,F(xiàn)ASN、ACC、LXRα、LXRβ、SREBP1、SCD1、ACSS1、DGAT1、DGAT2和SP1基因表達量顯著上調(diào)(P<0.05),F(xiàn)ABP3基因表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),感染重組腺病毒Ad-EGFR36h以上乳腺上皮細胞中EGFR蛋白顯著表達,而且EGFR蛋白能夠被組成
5、性激活。
(4)成功合成針對EGFR基因的siRNA序列,轉(zhuǎn)染山羊原代乳腺上皮細胞24h后通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)ACSL1、DGAT2、PRLR和LF基因顯著上調(diào)(P<0.05),SCD1、FASN、ACC、LXRα、LXRβ和SP1基因顯著下調(diào)(P<0.05),而乳鐵蛋白的表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(P<0.05)。
綜上所述:本研究成功克隆得到了EGFR基因的CDs區(qū)序列,并通過該序列原核表達出截短型EGFR蛋白,制備
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