亮氨酸通過蛋白酶體調控犢牛胰腺腺泡細胞淀粉酶的分泌.pdf

1、胰腺作為重要的消化器官，其分泌的淀粉酶在動物消化利用小腸淀粉的過程中發(fā)揮著關鍵作用。奶牛十二指腸中的淀粉僅有42％-60％可被消化吸收，胰腺淀粉酶分泌的不足是限制奶牛等反芻動物小腸淀粉利用的主要因素。本研究利用改進的胰蛋白酶冷消化法分離荷斯坦犢牛胰腺腺泡細胞，并在此基礎上通過體外細胞培養(yǎng)試驗，研究亮氨酸對犢牛胰腺腺泡細胞淀粉酶分泌的影響及相應的調控機制，以期為通過營養(yǎng)手段改善奶牛等反芻動物小腸淀粉消化提供理論參考。主要結果如下:

2、　　犢牛胰腺腺泡細胞的分離技術研究使用改進后的胰蛋白酶冷消化法分離奶犢牛胰腺腺泡細胞，對分離得到的細胞進行形態(tài)學觀察，并設置3、6、9小時的孵育時間梯度處理，對獲得的細胞數(shù)目及活率進行計數(shù)。結果表明:犢牛胰腺腺泡細胞的形態(tài)結構和小鼠及大鼠的胰腺腺泡細胞相似，均為懸浮細胞，細胞內可見大量的酶原顆粒。孵育6小時和9小時時獲得的細胞數(shù)目較3小時明顯升高(P＜0.05)，活率并無顯著差異(P＞0.05)。
　　亮氨酸對犢牛胰腺腺泡細胞淀粉

3、酶分泌的影響體外培養(yǎng)新鮮分離的犢牛胰腺腺泡細胞，培養(yǎng)液使用無亮氨酸的DMEM/F12，分別添加其正常亮氨酸濃度的0、0.5、1、3、9、27倍梯度處理（即0、0.225、0.45、1.35、4.05和12.15mmol/L）并于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3小時。結果顯示:(1)隨著培養(yǎng)液中亮氨酸濃度由0倍提高至0.5、1、3倍時，上清培養(yǎng)液中的酶活出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05），當亮氨酸添加濃度繼續(xù)升高時，酶活并未繼續(xù)降低(P＞0.05）;(2

4、)相較于0倍對照組，其他幾個亮氨酸濃度處理組的AF及CCK1R的蛋白表達均出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05）;(3)相較于對照組，其他幾個亮氨酸濃度處理組的蛋白酶體活性出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05），分別為對照組的76％、63％、24％、7％和9％。
　　蛋白酶體對犢牛胰腺腺泡細胞淀粉酶分泌調控在試驗二結果的基礎上，以犢牛胰腺腺泡細胞為研究對象，設置無亮氨酸、正常濃度亮氨酸和高濃度亮氨酸（即0、1、27倍濃度，對應0、0.45、12.

5、15mmol/L）的單獨添加及相應濃度的亮氨酸與5μmol/L蛋白酶體抑制劑MG-132的混合添加處理，于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3小時。結果顯示:(1)0倍和1倍添加組中亮氨酸和MG-132的混合添加相較于亮氨酸的單獨添加，培養(yǎng)液上清中的α-淀粉酶量出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05），27倍添加組中，亮氨酸和MG-132的混合添加并未降低α-淀粉酶的分泌(P＞0.05);(2)0倍和1倍組中，MG-132的添加均降低了CCK1R的蛋白表達水平(

6、P＜0.05），27倍組中，MG-132的添加有降低CCK1R表達的趨勢(P＜0.1）;(3)0倍和1倍亮氨酸添加組中，亮氨酸和MG-132的混合添加均顯著降低了蛋白酶體的活性(P＜0.05），分別為單獨添加相應濃度亮氨酸時蛋白酶體活性的63％和72％。27倍亮氨酸添加組中亮氨酸與MG-132的混合添加相較于亮氨酸的單獨添加，蛋白酶體的活性并未出現(xiàn)顯著變化(P＞0.05）。
　　結論:改進的胰蛋白酶冷消化法適用用于分離制備體犢牛胰