蛋白酶體抑制通過激活GSK-3減輕心肌肥大.pdf

1、目的：
　　1.蛋白酶體抑制對心肌肥大和GSK-3活性的影響。
　　2.蛋白酶體抑制通過激活GSK-3減輕心肌肥大的機制。
　　方法：
　　利用原代新生心肌細胞進行實驗，AngⅡ誘導心肌細胞肥大模型，同時給予蛋白酶體抑制劑MG132處理。熒光定量PCR法檢測肥大基因ANF mRNA的表達和免疫化學熒光法測量心肌細胞表面積作為心肌肥大指標。用熒光底物法檢測蛋白酶體活性，Western-blot法檢測心肌細胞GSK-

2、3及其磷酸化蛋白表達的情況，給予GSK-3抑制劑LiCl，研究蛋白酶體抑制通過激活 GSK-3減輕心肌細胞肥大的機制，Western-blot法檢測上游因子Akt、AMPKɑ及其磷酸化水平變化，以及β-Catenin、Histone H3磷酸化水平變化，并用免疫化學熒光法觀察GATA4核內外表達的變化。
　　腹主動脈縮窄術（abdominal aortic Constriction，AAC）建立大鼠壓力超負荷心肌肥厚模型，隨機分為

3、Sham組，AAC組，AAC+ MG132組，AAC+MG132+LiCl。8周后檢測超聲腹主動脈血管、動物心臟驗證壓力超負荷性模型建立成功。小動物超聲成像系統(tǒng)檢測大鼠心臟功能，病理組織切片HE染色方法檢測大鼠心肌細胞形態(tài)；用熒光定量PCR法檢測肥大基因ANF mRNA的表達；用熒光底物法檢測蛋白酶體活性；Westernblot法檢測GSK-3活性表達情況，以及下游因子β-Catenin磷酸化和GATA4水平表達變化。
　　結果<

4、br>　　1.蛋白酶體抑制劑 MG132能夠使心肌細胞肥大基因 ANF mRNA水平降低(P<0.05)，心肌細胞表面積減小(P<0.05)；降低AngⅡ誘導心肌肥大細胞的 GSK-3ɑ（Ser21）和GSK-3β（Ser9）磷酸化水平，從而升高GSK-3活性(P<0.05)。
　　2.GSK-3抑制劑LiCl阻斷GSK-3通路，逆轉蛋白酶體抑制對心肌細胞肥大的保護作用，使肥大基因ANF mRNA水平升高(P<0.05)，心肌細胞

5、表面積增加(P<0.05)。
　　3.蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制心肌肥大細胞GSK-3上游因子Akt，AMPKɑ活性升高的作用，使其磷酸水平降低，活性下降(P<0.05)；心肌肥大模型組p-β-Catenin水平升高，MG132處理后p-β-Catenin水平下降，而GSK-3抑制劑LiCl能夠逆轉 MG132的作用，使p-β-Catenin水平又明顯升高(P<0.05)，心肌細胞表面積增大(P<0.05)；蛋白酶體抑制劑M

6、G132降低AngⅡ誘導心肌細胞肥大引起Histone H3磷酸化水平變化的作用，從而使其活性減低(P<0.05)；而GSK-3抑制劑LiCl對其沒有明顯作用(P<0.05)。免疫熒光顯示，對照組GATA4主要位于胞漿中，而模型組和LiCl處理組顯示GATA4核內表達均明顯增加，而MG132處理組顯示GATA4核內表達明顯下降，胞漿表達增加。
　　4.超聲腹主動脈血管圖顯示，Sham組血管正常，而AAC組腹主動脈血管狹窄成功，狹窄

7、率達70％-80%。
　　5.與Sham組相比，AAC組8周后的左心室體重比顯著增加(P<0.05)。超聲心動圖結果顯示：與Sham組相比，8周后AAC組左心室舒張期和收縮期前、后壁厚度（LVAW，LVPW），左心室收縮和舒張末期內徑（LVID），左心室射血分數EF（%）和短軸縮短速率FS（%）等心功能指標顯著增加，AAC+MG132組各心功能指標有所減低，AAC+MG132+LiCl組阻斷GSK-3通路，使大鼠心肌肥厚加重，各心

8、功能指標顯著增加，均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　6.HE染色結果顯示AAC組和AAC+MG132+LiCl組均比Sham組和AAC+MG132組間質纖維結締組織增生，橫紋肌紊亂，心肌細胞體積增大、排列不整齊，熒光定量 PCR結果顯示肥大基因ANF mRNA水平降低(P<0.05)。
　　7.Western blot結果顯示大鼠AAC組比Sham組GSK-3，β-Catenin磷酸化水平升高，GATA4水平升高，AA

9、C+ MG132組GSK-3磷酸化水平明顯升高，p-β-Catenin和GATA4水平明顯降低(P<0.05)，AAC+ MG132+ LiCl組GSK-3活性相對降低，而p-β-Catenin和GATA4水平恢復升高，均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　小結
　　1．蛋白酶體抑制可以減輕心肌細胞肥大，并使GSK-3活性升高。
　　2．蛋白酶體抑制通過升高GSK-3活性從而減輕心肌細胞肥大。
　　3．蛋白酶體

10、抑制通過抑制Akt和AMPK?活性，而激活GSK-3，從而調節(jié)GATA4的核內外分布，進而減輕心肌細胞肥大。
　　4．腹主動脈縮窄8周后大鼠心臟收縮功能障礙，代償性生長加重，并引起嚴重的左心室肥厚。
　　5．體內試驗中蛋白酶體抑制通過升高GSK-3活性進而調節(jié)GATA4水平來減輕大鼠心肌肥厚。
　　全文結論
　　本研究采用了AngⅡ誘導心肌細胞肥大和腹主動脈縮窄構建壓力超負荷性心肌肥厚模型分別在體外實驗和體內實驗