PKD通過蛋白酶體通路增強HepG2細胞的放射敏感性.pdf

1、研究背景： 生物信息學分析表明乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）中存在與Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑高度同源的"Kunitz結構域"，該結構對其功能至關重要。HBx與絲氨酸蛋白酶的抑制因子競爭結合肝細胞來源的絲氨酸蛋白酶，擾亂細胞內轉錄因子的水解途徑，而行使其反式激活功能。蛋白酶體為普遍存在于真核生物、古菌、原核生物中的一類蛋白質復合物。在真核生物中，蛋白酶體位于細胞核和細胞質中。蛋白酶體是細胞用來調控特定蛋白質和除去錯誤折疊蛋白

2、質的主要機制。蛋白酶體降解途徑對于許多細胞進程，包括細胞周期、基因表達的調控、氧化應激反應等，都是必不可少的。細胞周期進程是由一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來進行調控的，而CDK則是由細胞周期蛋白（cyclin）來激活。有絲分裂的細胞周期蛋白是所有已知的細胞內蛋白中壽命最短的。在CDK-cyclin復合物行使了它的功能之后，復合物中的cyclin就會被多泛素化并由蛋白酶體降解，從而保證了細胞周期的正常運轉。細胞內外的信號都能夠誘

3、導細胞凋亡或程序化細胞死亡，細胞內部的組分發(fā)生解構，這一過程主要是由特定的蛋白酶半胱天冬酶（caspase）來完成，但同時蛋白酶體在細胞凋亡過程中行使多種重要的作用。蛋白酶體的抑制作用可以影響不同類型細胞的調亡誘導，在大多數(shù)研究的細胞中，抑制蛋白酶體可以促進細胞調亡。蛋白酶體抑制劑對于體外培養(yǎng)的細胞具有有效的抗腫瘤活性，通過降解受調控的促生長細胞周期蛋白來誘導腫瘤細胞的凋亡。因此一些蛋白酶抑制劑已被開發(fā)應用于臨床的腫瘤治療。 研

4、究目的： 本研究合成與HBx的Kunitz結構域序列相同的一肽段（PKD），探討其是否通過抑制蛋白酶體的活性、調控與蛋白酶體降解通路相關的VCP、細胞周期素和細胞周期素依賴性蛋白激酶等蛋白的表達，并由此對HepG2細胞的細胞周期、細胞凋亡和放射敏感性產生影響。 研究方法： 利用蛋白質分析軟件Vector NTI6．0對HBx同源性進行分析，設計合成PKD的序列。利用固相多肽合成技術化學合成與HBx羧基端九個氨基酸

5、序列完全一致的肽段Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys，探討其對HepG2細胞的作用。通過高壓液相色譜法（HPLC）和質譜對純化后PKD再進行鑒定。用MTT方法檢測PKD對HepG2細胞生長的影響：采用比色分析法檢測蛋白酶體的ATP酶活性；通過分析對不同肽酶特異性熒光肽底物LLE-NA，LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解，分析蛋白酶體的類胰凝乳蛋白酶、類胰蛋白酶和肽谷氨?；乃饷富钚?；利用Ali

6、gnX軟件對GenBank中VCP的同源性進行分析，利用DNAStar7軟件分析VCP序列的特點，根據(jù)對其親水性結構、柔韌區(qū)、抗原指數(shù)及表面概率結構參數(shù)綜合分析，選擇人類VCP的637～647位和689～696位兩段序列，設計用于制備VCP抗體的19個氨基酸融合肽的序列GRLDQLIYIPLEICQRACK。 利用固相多肽技術合成VCP融合肽，將其與載體蛋白KLH偶聯(lián)形成VCP-KLH。利用常規(guī)免疫方案用VCP-KLH免疫BAL

7、B/c小鼠，制備VCP的多克隆抗體，再通過ELISA技術檢測其效價。利用實驗所制備的鼠抗VCP抗體，進行Western蛋白印跡，檢測VCP的表達。通過免疫組織化學法檢測HepG2細胞中P27，Cyclin E，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as和Caspase-8的表達。利用利用熒光素（FITC）標記的凋亡相關蛋白TFAR19單克隆抗體，對HepG2細胞進行標記，觀察PKD對HepG2細胞誘導細胞凋亡的形態(tài)學變化。流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋

8、亡的改變。通過細胞照射及克隆形成實驗觀察PKD對HepG2細胞放射敏感性的影響。 研究結果： 合成的PKD肽Phe-Val-Leu-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys純化后，經HPLC檢測純度>97％，質譜鑒定合成PKD的氨基酸組成和序列正確。 MTT方法檢測0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和15mmol/L的PKD對HepG2細胞生長的影響，結果顯示HepG2細胞的活力隨PK

9、D劑量增加呈現(xiàn)出降低的趨勢，15mmol/L的PKD有明顯的細胞毒性。 通過分析對不同肽酶特異性熒光肽底物LLE-NA，LLVY-AMC和LSTR-AMC的水解，實驗發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中10mmol/L的PKD可顯著地抑制蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性（p<0．05），但對其胰蛋白酶樣和肽-谷氨酰肽樣酶活性較糜蛋白酶樣活性相比抑制作用弱。此外進一步觀察隨時間的變化，PKD對蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性影響的反應動力學改變。PKD未作用的

10、蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性在12分鐘左右，反應趨于高峰并漸趨平坦。10mmol/L的PKD則使蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性一直處于抑制狀態(tài)。 蛋白酶體的ATP酶活性為2．5h時限，利用抗蛋白酶體的抗體和偶聯(lián)有蛋白G瓊脂糖微球對蛋白酶體復合體進行免疫共沉淀。10mmol/L的PKD處理的HepG2細胞與未經PKD處理的相比較，PKD顯著地抑制蛋白酶體復合體的ATP酶活性。 用ELISA法測定VCP融合肽抗血清的效價為1：1000

11、0。10mmol/L的PKD作用HepG2細胞36h后，收集細胞裂解，提取蛋白進行Western蛋白印跡，分析VCP的表達。對于相同蛋白濃度的樣品，與未用PKD處理的HepG2細胞相比，PKD處理的HepG2細胞的Western蛋白印跡可見條帶（97kDa）的密度明顯減弱，表明PKD較明顯地抑制VCP的表達。 免疫組織化學法檢測HepG2細胞中P27，Cyclin E，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as和Caspase-8的表達，結果顯

12、示經10mmol/L的PKD作用于HepG2人肝癌細胞株后，P27蛋白的水平明顯升高，與空白對照組比較均有顯著性改變。PKD作用后的HepG2細胞中p27以胞核及核周出現(xiàn)棕黃色。PKD未作用的HepG2細胞沒有明顯的陽性著色。PKD上調P27在HepG2細胞中的表達。 PKD合成肽處理的HepG2中大多數(shù)細胞Cylin E染色呈現(xiàn)陰性，其胞核不著色，細胞漿和細胞膜呈藍色。未經PKD干預的H印G2其Cylin E蛋白表達明顯，主

13、要分布于核周圍的胞漿和細胞核內，呈均勻的棕黃色細顆粒狀。PKD抑制HepG2細胞中周期蛋白質Cyclin E的表達。 10mmol/L的PKD可明顯促進HepG2細胞中Bax的表達，Bax蛋白呈深黃色染色、彌漫性或局限性分布于細胞漿，胞核藍染。空白對照的HepG2細胞呈陰性。PKD促進HepG2細胞中Bax蛋白的表達。 HepG2細胞均為Bcl-2陽性著色細胞，Bcl-2棕黃色顆粒狀，主要定位于胞漿中。10mmol/L

14、的PKD可完全抑制Bcl-2的表達，PKD處理后的HepG2細胞未見陽性染色。PKD抑制HepG2細胞中Bcl-2蛋白的過表達。 HepG2細胞未出現(xiàn)明顯的陽性染色，但當10mmol/L的PKD作用HepG2細胞后，陽性表達的Fas反應物為棕黃色顆粒，分部于胞漿和胞膜。PKD提高HepG2細胞中Fas蛋白的表達。 與空白對照組的HepG2細胞相比較，10mmol/L的PKD可明顯增加HepG2細胞中Caspase-8的

15、表達，Caspase-8蛋白呈深黃色染色分散于胞漿和胞核。PKD誘導HepG2細胞中Caspase-8的表達。 本研究證實P27，Bax，F(xiàn)as和Caspase-8在10mmol/L PKD作用的HepG2細胞中表達明顯增高，但是cyclin E與Bcl-2的表達降低。10mmol/L PKD作用HepG2細胞36小時可致使細胞滯留于G0-G1期，并產生明顯的細胞凋亡，未處理的細胞則大部分進入S期。利用熒光素（FITC）標記的單

16、克隆抗體為探針，示蹤一新的凋亡相關分子TFAR19，PKD作用的HepG2細胞出現(xiàn)典型細胞凋亡的形態(tài)學改變。5mmol/L PKD干預和空白對照組細胞在接受不同劑量的照射后，克隆形成實驗結果經Sigma Plotll軟件以多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）n擬合細胞存活曲線，并計算細胞的放射敏感性參數(shù)。5mmol/LPKD增加HepG2細胞的放射敏感性30％（SERD0=1．34、SERDq=1．24、SERSF2=1．29）。