轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2對(duì)培養(yǎng)的小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用的研究.pdf

1、目的：觀察TGF-B<,2>(Transforming Growth Factor-B<,2>)是否能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞(Retina Stem Cell，RSC)的分化；并以胎牛血清為對(duì)照，觀察其對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的強(qiáng)弱。 方法 1、RSC的分離培養(yǎng)及鑒定孕齡17 d(天) 的昆明小鼠處死，取出胚胎，迅速剖出胎鼠的眼球，在手術(shù)顯微鏡下分離視網(wǎng)膜干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，傳代，完成第六代傳代后，進(jìn)行視網(wǎng)膜干細(xì)

2、胞的Nestin和CHX-10免疫熒光鑒定。 2、RSC的誘導(dǎo)分化及鑒定將第六代細(xì)胞離心，沖洗，重新接種于培養(yǎng)瓶，然后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分為10％胎牛血清誘導(dǎo)分化組，TGF-B<,2>(10ngPml)誘導(dǎo)分化組，和空白對(duì)照組。并進(jìn)行抗GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)、抗Opsin、抗B-tubulinⅢ、抗PKC(Protein Kinase c)免疫熒光染色，鑒定終末細(xì)胞。 3、

3、熒光顯微鏡下觀察結(jié)果在熒光顯微鏡下隨機(jī)數(shù)10個(gè)非重疊視野(×20)，計(jì)算抗GFAP、抗Opsin、抗B-tubulinⅢ、抗PKC陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，即：陽性細(xì)胞率。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，比較不同條件誘導(dǎo)分化的終末細(xì)胞的陽性率是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。觀察不同的誘導(dǎo)條件對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的強(qiáng)弱。 結(jié)果 1、體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜干細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)觀察及熒光鑒定分離的視網(wǎng)膜干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)可形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)多次傳代，細(xì)胞

4、增殖能力未見衰減。到第6代，培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞折光性強(qiáng)，細(xì)胞團(tuán)邊緣的細(xì)胞界限比較清楚。分別對(duì)細(xì)胞團(tuán)的Nestin和Chx-10抗原進(jìn)行熒光染色，Nestin和Chx-10染色陽性表明所培養(yǎng)細(xì)胞為胚胎發(fā)育早期視網(wǎng)膜內(nèi)原始細(xì)胞。 2、三組分化細(xì)胞的熒光檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)10％胎牛血清和TGF-B<,2>(10ngPml)誘導(dǎo)可向成熟細(xì)胞分化，免疫熒光檢測(cè)顯示分化細(xì)胞可分別表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞以及節(jié)細(xì)胞的特異性抗

5、原GFAP、Opsin、PKC及B-tubulinⅢ。在未加胎牛血清和TGF-B<,2>的空白對(duì)照組僅見極少量的分化細(xì)胞。 3、熒光顯微鏡下觀察結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果DMEM/F12+10％胎牛血清組和DMEM/F12+TGF-B<,2>(10ngPml)組誘導(dǎo)分化后的抗B-tubulinⅢ、抗Opsin、抗GFAP、抗PKC陽性細(xì)胞率分別進(jìn)行比較，行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值均<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 1、TGF