siRNA抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β對小鼠黃韌帶骨化的影響.pdf

1、研究背景:
　　黃韌帶骨化性疾病是一種臨床上常見的疾病，許多因素參與其發(fā)病過程，例如年齡、種族、基因等;生長因子、應(yīng)力改變也參與其中。但是目前病因與發(fā)病機(jī)制未明，與骨的形成有關(guān)的生長因子，比如轉(zhuǎn)化生長因子超家族們，他們在黃韌帶骨化性疾病的發(fā)病過程中扮演著非常重要的作用。國際上已經(jīng)確認(rèn)的是TGF-β1、BMP-2參與了韌帶骨化的不同時期[1]。然而TGF-β1與BMP-2基因表達(dá)的關(guān)系及在人脊柱黃韌帶骨化進(jìn)程中的作用，國內(nèi)外報(bào)道很少

2、。
　　本研究從病因?qū)W入手，模擬脊柱韌帶骨化的病理生化過程，通過siRNA技術(shù)，靶向沉默小鼠黃韌帶細(xì)胞TGF-β1基因，觀察沉默TGF-β1后其對小鼠黃韌帶細(xì)胞成骨分化的影響，找尋一種高效、專一的阻止脊柱黃韌帶骨化的方法，不僅為減小該病的發(fā)病率，也為該類疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療拓展出一個新的思路。
　　目的:
　　運(yùn)用siRNA技術(shù)抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在已骨化的小鼠黃韌帶成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對小

3、鼠脊柱黃韌帶細(xì)胞骨化的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用外科顯微器械取出小鼠胸椎黃韌帶成纖維細(xì)胞，然后離體培養(yǎng)，借助人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)配制成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，對向成骨細(xì)胞方向分化的黃韌帶細(xì)胞，在顯微鏡下行形態(tài)學(xué)觀察并對其行堿性磷酸酶(ALP)染色與鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色;構(gòu)建靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)載體(siRNA-pSilencer2.0U6-TGFβ1)并轉(zhuǎn)染已骨化的細(xì)胞

4、，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中TGF-β1、BMP-2的表達(dá);Real-timePCR檢測TGF-β1mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化;Westernblotting檢測TGF-β1和BMP-2蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對細(xì)胞中ALP、骨鈣素(OC)水平變化進(jìn)行測定。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)骨化成功后，對小鼠黃韌帶細(xì)胞觀察及細(xì)胞ALP染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色呈現(xiàn)陽性，具有成骨細(xì)胞典型生物學(xué)特征。構(gòu)建

5、的siRNA載體真核質(zhì)粒對細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，免疫熒光檢測顯示TGF-β1和BMP-2熒光強(qiáng)度下降;Real-timePCR檢測顯示:實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組及空白對照組比較，TGF-β1mRNA表達(dá)分別下降41.94％、47.82％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);Westernblotting檢測顯示:實(shí)驗(yàn)組較陰性對照組和空白對照組TGF-β1/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降35.88％、44.75％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);BMP

6、-2/β-action蛋白比值表達(dá)分別下降81.79％、86.06％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);ELISA檢測顯示:較陰性對照組和空白對照組，實(shí)驗(yàn)組ALP表達(dá)分別下降24.14％、32.30％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;實(shí)驗(yàn)組OC分別下降17.01％、21.63％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.靶向TGF-β1基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒能夠有效抑制已骨化的成纖維細(xì)胞中TGF-β1的