不同處理油松cDNa-SRAP PCR體系建立及基因表達(dá)差異分析.pdf

1、本研究以河北省承德市平泉縣不同林分油松林為研究對(duì)象，通過(guò)野外試驗(yàn)處理和室內(nèi)分子實(shí)驗(yàn)分析，設(shè)置對(duì)照處理，每株10頭油松毛蟲（Dendrolimus tabulaeformis）取食處理，每株30頭油松毛蟲取食處理和剪葉處理（剪葉處理程度與30頭油松毛蟲取食處理相同），結(jié)合cDNA-SRAP的基因表達(dá)差異研究方法，初步研究了自然條件下不同林分油松在不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異，分析產(chǎn)生差異的原因，以及差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行分析，為進(jìn)一步確認(rèn)

2、油松在自然環(huán)境下林分類型和油松毛蟲取食的共同作用下產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的結(jié)構(gòu)機(jī)制研究提供基因?qū)用娴淖C據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)對(duì)PCR反應(yīng)體系的TaqDNA聚合酶、模板cDNA、引物、Mg2+、dNTP這五個(gè)因素在四個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化。使用SPSS軟件對(duì)PCR結(jié)果結(jié)合方差分析和直觀分析。確定了可用于油松研究的cDNA-SRAP最優(yōu)的擴(kuò)增反應(yīng)體系(20μL):Taq酶2.0U，CDNA模板用量80～120

3、 ng，引物濃度0.4μmol/L，Mg2+濃度1.5 mmol/L，dNTP濃度0.2 mmol/L，2μL00×Taq Buffer，用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，35℃退火50 s，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán);94℃變性50 s，將退火溫度升為50℃退火50 s，72℃延伸0 min，35個(gè)循環(huán);最后，72℃延伸10 min;4℃保存。
　　(2)利用優(yōu)化后的cDNA-SRAP技

4、術(shù)，對(duì)225對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，從中選取20對(duì)引物組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共擴(kuò)增的到油松基因表達(dá)差異條帶256條，基因表達(dá)差異條帶92條。純林?jǐn)U增出118條，其中包含差異表達(dá)片段45條;混交林?jǐn)U增出138條，其中包含差異表達(dá)片段47條。10頭油松毛蟲取食處理共得到基因表達(dá)差異24條，30頭油松毛蟲取食處理共得到基因表達(dá)差異條帶37條，剪葉處理共得到基因表達(dá)差異條帶31條。結(jié)果顯示，產(chǎn)生的基因表達(dá)類型主要是上調(diào)表達(dá)型和下調(diào)表達(dá)型;不同林分類型中

5、的油松基因表達(dá)差異不明顯;不同處理對(duì)油松的基因有著明顯的誘導(dǎo)作用，并且誘導(dǎo)作用隨著脅迫處理的強(qiáng)度增加而增強(qiáng)，增強(qiáng)的效果使得某些基因表達(dá)增強(qiáng)。機(jī)械損傷也可以誘導(dǎo)油松產(chǎn)生基因表達(dá)差異，但作用強(qiáng)度弱于相同強(qiáng)度的油松毛蟲取食。
　　(3)對(duì)10個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄衍生片段進(jìn)行了測(cè)序，根據(jù)其堿基序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行了Blast-X的比對(duì)，其中四個(gè)片段找到了相應(yīng)的同源蛋白。分別是TDF-1、TDF-2、TDF-4、TDF-8，長(zhǎng)度分別為253