小分子G蛋白R(shí)hoA在血管重塑中的功能研究.pdf

1、【研究背景和目的】血管重塑是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理生理基礎(chǔ)。小分子G蛋白R(shí)hoA的主要功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，其激活后可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）收縮、增殖和遷移，參與血管重塑。近年研究表明血管外膜也是血管重塑的重要參與者，以往用熒光差別顯示聚合酶鏈反應(yīng)（Fluo-DD-PCR）技術(shù)發(fā)現(xiàn)RhoA在血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)中表達(dá)，并初步研究了RhoA參與AF表型轉(zhuǎn)化的作用。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討RhoA在血管外膜

2、重塑中的作用和機(jī)制，旨在發(fā)現(xiàn)血管外膜參與血管重塑的分子機(jī)制，為血管重塑相關(guān)疾病的臨床防治提供新策略。 【方法】應(yīng)用pAdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)，細(xì)菌同源重組法構(gòu)建重組腺病毒載體，成功構(gòu)建了表達(dá)目的基因dominant-negative N19RhoA的重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP，同時(shí)構(gòu)建Ad-CMV-eGFP為對(duì)照病毒，感染體外培養(yǎng)的SD大鼠AF，免疫印跡觀察其對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngII)刺激的AF/M

3、F細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)記分子a平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SM-actin）表達(dá)的影響。通過(guò)BrdU摻入檢測(cè)Ad-CMV-N19RhoA-eGFP對(duì)AngII刺激的AF/MF細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)用Rho pull-down方法體外檢測(cè)RhoA活性。建立SD大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，通過(guò)重組腺病毒載體介導(dǎo)外膜局部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)dominant negative N19RhoA，分別于術(shù)后7d、14d處死，細(xì)胞增殖核抗原PCNA、a-SM-actin免疫組織化學(xué)

4、、血管組織形態(tài)學(xué)觀察其對(duì)外膜細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化、遷移以及血管損傷后新生內(nèi)膜生成的影響。 【結(jié)果】 1.成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP和Ad-CMV-eGFP。 2.10-7mol/L AngII刺激體外培養(yǎng)的AF 細(xì)胞30min，其RhoA活性即較對(duì)照增強(qiáng)約3倍。 3.Ad-CMV-N19RhoA-eGFP (MOI=200)可明顯降低AngII (10-7mol/L)誘導(dǎo)的A

5、F/MF細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)記分子 a-SM-actin的表達(dá)。 4.Ad-CMV-N19RhoA-eGFP(MOI=200)明顯抑制AngⅡ(10-7mol/L)誘導(dǎo)的AF細(xì)胞 BrdU摻入。 5.免疫印跡結(jié)果顯示正常大鼠血管組織RhoA蛋白表達(dá)量較低，球囊損傷術(shù)后14d，大鼠損傷血管組織的RhoA蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組升高約4倍。 6.球囊損術(shù)后7d、14d，損傷血管大量新生內(nèi)膜形成，血管腔明顯狹窄，同時(shí)血管組織大

6、量PCNA、a-SM-actin表達(dá)。 7.重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP(5×108pfu/只)局部轉(zhuǎn)染血管外膜，免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管組織eGFP表達(dá)，損傷血管外膜、中膜和新生內(nèi)膜均有eGFP表達(dá)，而未損傷血管eGFP只在外膜表達(dá)。N19RhoA高表達(dá)使術(shù)后14d血管外膜、中膜和新生內(nèi)膜eGFP陽(yáng)性細(xì)胞較空病毒組減少了29.8±4.2％，并明顯抑制PCNA、a-SM-actin表達(dá)，顯著減少了術(shù)后新生內(nèi)膜生成