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文檔簡介
1、結(jié)直腸癌是危害人類生命健康的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示,2012年度全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例140萬左右,死亡病例693900,其中發(fā)病率在男性中排名第三,女性中排名第二,死亡率在男性中排名第四,女性排名第三。在我國隨著人民生活水平的提高,誘發(fā)結(jié)直腸癌的高危因素也在同步廣泛流行,包括人口老齡化的發(fā)生、不健康的飲食方式、肥胖、吸煙等,因而近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升。而腫瘤的轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌致死的主要原因,也是影響患者預(yù)
2、后的重要因素。
為了探究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制,我們課題組為此展開了系列研究。MC3是我們實驗室前期自主建立的一株結(jié)腸癌特異單抗,我們鑒定出其識別的抗原為Txl-2,后期發(fā)現(xiàn)Txl-2的剪接體Txl-2b與小G蛋白Ran相互作用,顯著促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上,我們對Ran做了功能學(xué)驗證和機制探索。結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌組織中、胃癌組織中、胰腺癌組織中的表達顯著高于正常組織,并且其高表達與腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。在結(jié)直腸
3、癌細胞和胰腺癌細胞中,干擾Ran的表達可引起細胞體內(nèi)體外增殖能力減弱。在胰腺癌細胞,Ran表達的下調(diào)可引起細胞凋亡增加,細胞遷移及侵襲能力明顯下降,研究還發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機制與細胞周期相關(guān)蛋白及存活素Survivin表達下調(diào),凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達上調(diào)有關(guān)。而其促進侵襲轉(zhuǎn)移的機制則與雄激素受體Androgen Receptor、趨化因子CXCR4可能相關(guān)。研究至此,尚無直接證據(jù)證明Ran可以促進結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移,同時R
4、an在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制仍不清楚。
【目的】
1.檢測并分析Ran在結(jié)直腸癌中病理組織及細胞系中的表達與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
2.研究Ran對結(jié)直腸癌細胞系遷移侵襲能力的影響。
3.探索Ran促進結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制。
【方法】
1.小G蛋白Ran在組織與細胞中的表達檢測:
?。?)免疫組織化學(xué)檢測 Ran在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和配對陽性淋巴結(jié)中的表達,分析Ran的表
5、達強度與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
?。?)Western blot檢測Ran在永生化正常腸上皮細胞HIEC、結(jié)直腸癌細胞系SW480、SW620、HCT116、Caco-2、HT-29、LoVo核蛋白中的表達情況。
?。?)免疫熒光檢測Ran在結(jié)直腸癌細胞SW480、SW620的亞細胞定位情況及熒光表達強弱情況。
2.構(gòu)建Ran的功能獲得、功能缺失細胞模型:
?。?)將Ran特異性O(shè)ligo siRNA轉(zhuǎn)染
6、入結(jié)直腸癌細胞,在蛋白水平驗證通過 Western blot驗證siRNA的干擾效果。
(2)將最有效的的siRNA包裝構(gòu)建成慢病毒,穩(wěn)定下調(diào)Ran的表達,并通過Western blot和熒光檢測進行驗證。
?。?)構(gòu)建并轉(zhuǎn)染過表達Ran的慢病毒,并通過Western blot進行過表達驗證。
3. Ran對結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響:
?。?)體外實驗通過Transwell遷移和侵襲實驗觀察Ra
7、n的功能獲得和功能缺失細胞模型遷移和侵襲能力的變化。
?。?)體內(nèi)實驗通過裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移觀察Ran功能獲得和功能缺失細胞模型在體內(nèi)侵襲能力的變化。
4. Ran調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究
(1)利用Nanostring檢測技術(shù)探索Ran下游的分子表達變化及可能的信號通路。
(2)利用高通量表達譜芯片探索Ran下游的分子表達變化及可能的信號通路。
?。?)通過RNAi技術(shù)、Western
8、blot檢測雄激素受體AR、LIN28B與Ran的表達失調(diào)的關(guān)系,通過Transwell遷移實驗驗證AR、LIN28B在結(jié)直腸癌細胞遷移能力中的影響。
【結(jié)果】
1.在34例結(jié)直腸癌組織及其配對的陽性淋巴結(jié)標(biāo)本中,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶(陽性淋巴結(jié))中的陽性表達率明顯高于結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達,P<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.結(jié)直腸癌細胞系及永生化正常腸上皮細胞的核蛋白中Ran表達存在
9、差異,在人永生化正常腸上皮細胞HIEC表達極少,在高轉(zhuǎn)移細胞系SW620、HCT116、Caco-2中Ran的表達明顯高于低轉(zhuǎn)移細胞系SW480、HT-29。
3.免疫熒光結(jié)果顯示,Ran主要定位于細胞核中,且高低轉(zhuǎn)移細胞系 SW620和SW480中Ran的表達存在差異。
4.合成的Ran特異的Oligo siRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)染和驗證,si-1干擾效果最好,經(jīng)過慢病毒包裝后,在高轉(zhuǎn)移細胞系HCT116中進行慢病毒轉(zhuǎn)染,經(jīng)
10、過嘌呤霉素篩選后,通過 Western blot和熒光顯影檢測,成功構(gòu)建了Ran的表達下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系HCT116-siRan及對照HCT116-siNC。
5.通過對低轉(zhuǎn)移細胞系SW480進行過表達慢病毒的轉(zhuǎn)染及續(xù)嘌呤霉素篩選,成功構(gòu)建了過表達Ran的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系SW480-Ran及對照SW480-NC。
6.體外實驗Transwell結(jié)果顯示細胞系HCT116-siRan的侵襲遷移能力較對照細胞系明顯減弱,細胞系S
11、W480-Ran的侵襲遷移能力較對照組明顯增強。該結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析有意義。
7.體內(nèi)裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗顯示細胞系HCT116-siRan裸鼠肝臟中形成的轉(zhuǎn)移瘤較對照組明顯減少,細胞系SW480-Ran在肝臟中形成的轉(zhuǎn)移灶則明顯多于對照組,且HCT116-siRAN組裸鼠的生存期較對照組延長,體重動態(tài)變化在第18天出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。
8.細胞系Sw480-Ran中AR與LIN28B的表達均發(fā)生了上調(diào),而在Caco-2細
12、胞中,干擾Ran的表達后AR、LIN28B的表達發(fā)生了下降。Ran、AR、LIN28B均主要表達在細胞核中,在Ran的表達下調(diào)后,AR、LIN28B的熒光表達也相應(yīng)的減弱。且干擾AR、LIN28B表達后可以減弱結(jié)直腸癌細胞的遷移能力。
9.通過送檢Nanostring以及高通量的表達譜芯片,對Ran的下游分子機制進行探索,篩選出一批差異表達的基因,我們后續(xù)將利用這些大數(shù)據(jù)對Ran下游的信號通路及分子事件進行生物信息學(xué)的分析,明
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