RhoA分子在登革2型病毒感染過程中的作用研究.pdf

1、登革病毒(dengue virus，DV)屬于黃病毒屬、是一種包膜的單股正鏈RNA 病毒。
　　 根據(jù)包膜蛋白的抗原性不同，可將登革病毒分為四個(gè)血清型，即DV1～4。DV 以蚊蟲為主要傳播媒介廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。每年，登革病毒會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬人感染，引起登革熱(dengue fever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合癥(dengue hemorrhagicfever/ dengueshock syndrome, DHF/D

2、SS)。DF是自限性發(fā)熱性疾病。而DHF/DSS 則是威脅患者生命的重癥，其主要特征是血管通透性顯著增加，導(dǎo)致血漿滲漏。每年大約有50萬DHF/DSS患者，如未及時(shí)治療，病死率可上升至50％。因而對(duì)其致病機(jī)理和預(yù)防手段的研究已成為亟待解決的前沿課題。
　　 研究表明，宿主細(xì)胞骨架在病毒的感染過程中發(fā)揮重要作用，而構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分微絲、微管、中間纖維在不同病毒的感染過程中分別扮演著不同的角色。我們小組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)微絲和波形蛋

3、白纖維在DV的感染及復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。DV的感染可以引起微絲骨架的改變，用微絲藥物破壞其聚合和解離的平衡，可以導(dǎo)致DV 感染受到抑制說明微絲聚合和解離的平衡對(duì)DV的感染具有重要意義。而調(diào)節(jié)微絲骨架的關(guān)鍵因子是Rho GTP 酶，作為分子開關(guān)Rho GTP 酶在無活性的GDP和有活性的GTP兩種形式間循環(huán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞周期等。
　　 Rho GTP 酶家族中研究的比較多的有3個(gè)成員：RhoA、Cdc4

4、2和Rac1。我們對(duì)波形蛋白纖維的研究發(fā)現(xiàn)，ECV304細(xì)胞在感染DV2后，細(xì)胞中的波形蛋白會(huì)發(fā)生重排，重排的波形蛋白從細(xì)胞邊緣回縮、環(huán)繞于細(xì)胞核周圍，并與病毒抗原共存，用丙烯酰胺長(zhǎng)時(shí)間作用細(xì)胞后，破壞波形蛋白會(huì)影響DV2的復(fù)制增殖。目前研究發(fā)現(xiàn)波形蛋白纖維的重排是由激酶磷酸化所致，而RhoA及其下游激酶ROCK (Rho associatedcoiled-coil forming protein kinase)在波形蛋白纖維磷酸化中扮

5、演著重要角色。為此，本課題以RhoA/ ROCK通路為研究對(duì)象，采用構(gòu)建RhoA 突變體及RhoA和ROCK 特異性抑制劑干擾RhoA/ ROCK通路的方法，觀察對(duì)DV 感染與復(fù)制的不同環(huán)節(jié)的影響，從而為解析DV 感染的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為預(yù)防和控制DV 感染提供新思路。
　　 本研究的主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：1．利用突變體觀察RhoA 功能的異常對(duì)DV 病毒感染的影響本實(shí)驗(yàn)用DV2 感染ECV304細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)RhoA

6、突變體的ECV304細(xì)胞株：
　　 ECV304N、ECVWtRhoA、ECVV14RhoA和ECVN19RhoA(MOI=1)，通過病毒噬斑計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)感染后1h細(xì)胞內(nèi)和24h細(xì)胞內(nèi)外的病毒滴度。結(jié)果顯示在病毒感染1小時(shí)后ECVN19RhoA、ECVWtRhoA、ECVV14RhoA細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度均低于ECV304和ECV304N，其中ECVV14RhoA、ECVWtRhoA下降比較明顯，而ECVN19RhoA下降較少，相

7、較于ECV304N的病毒滴度分別下降了49.71％、51.76％、20.59％。在病毒感染24小時(shí)后，細(xì)胞上清中的病毒滴度ECVV14RhoA、ECVWtRhoA和ECVN19RhoA 均低于ECV304N和ECV304，其中ECVV14RhoA、ECVWtRhoA下降比較明顯，而ECVN19RhoA下降不明顯，相較于ECV304N的病毒滴度分別下降了76.6％、77.2％、23％；細(xì)胞內(nèi)病毒滴度的變化與上清趨勢(shì)相符，即ECVV14Rh

8、oA、ECVWtRhoA下降比較明顯，而ECVN19RhoA下降不明顯。相較于ECV304N的病毒滴度分別下降了58.75％、62.32％、20.29％。結(jié)果提示：RhoA 功能的異常對(duì)DV2的感染有明顯的抑制作用。
　　 2．利用C3 轉(zhuǎn)移酶抑制RhoA 活性觀察對(duì)DV 感染的影響利用C3 轉(zhuǎn)移酶抑制ECV304細(xì)胞內(nèi)RhoA 活化后實(shí)施感染實(shí)驗(yàn)，收集病毒穿入細(xì)胞1h時(shí)的細(xì)胞樣本和感染后24 h 培養(yǎng)上清及細(xì)胞樣本進(jìn)行病毒滴度

9、檢測(cè)，結(jié)果顯示：藥物組病毒穿入1h后細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度相較于對(duì)照組的病毒滴度下降了88.46％；
　　 藥物組病毒感染24h 培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度相較于對(duì)照組分別下降了12.52％、82.35％。與免疫熒光及共聚焦顯微鏡觀察到的結(jié)果相符，即藥物處理組病毒抗原陽性的細(xì)胞數(shù)目明顯低于對(duì)照組。結(jié)果說明抑制RhoA 活化可明顯抑制DV 穿入宿主細(xì)胞及DV的復(fù)制增殖。
　　 3．采用G-lisa 檢測(cè)DV 病毒感染過程中Rho

10、A分子活性的變化用滅活DV2（56℃，30min）和DV2分別感染ECV304細(xì)胞。在感染30min，1h，8h及24時(shí)收集細(xì)胞樣品，采用G-LISATM RhoA Activation Assay BiochemKitTM(Cytoskeleton)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)RhoA分子的活性。結(jié)果顯示：在感染30min及1h時(shí)RhoA 活性較對(duì)照組有顯著升高，其中感染30min時(shí)最為明顯，感染后1h 開始下降。
　　 而在感染8h和24

11、h后RhoA分子活性較對(duì)照組沒有明顯變化。說明RhoA 活性主要在病毒穿入細(xì)胞的過程中被激活，而在病毒的復(fù)制增殖過程中沒有變化。
　　 4．利用Y-27632 抑制ROCK 活性觀察對(duì)DV 感染的影響使用ROCK 活性抑制劑Y-27632 抑制ROCK 活性后實(shí)施感染實(shí)驗(yàn)，收集感染后8h和24 h 培養(yǎng)上清和細(xì)胞樣本進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比藥物處理組（6個(gè)濃度處理）細(xì)胞上清和細(xì)胞樣本中病毒滴度均沒有明顯變化。與免