CQ復(fù)方對(duì)癌侵襲鏡像痛模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的及依據(jù)：
　　癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康、導(dǎo)致現(xiàn)代人類死亡的第一大惡疾和頑癥。癌痛是癌癥患者最常見的臨床癥狀之一，可以出現(xiàn)在癌癥的任何階段。其中癌侵襲痛（Cancer Invasion Pain，CIP）是由于腫瘤浸潤(rùn)引起的疼痛，在癌癥患者上頻發(fā)，是難治性癌痛之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIP動(dòng)物模型出現(xiàn)鏡像痛(Mirror Image Pain，MIP)，即在軀體損傷部位的對(duì)側(cè)對(duì)稱部位（鏡像部位）亦出現(xiàn)疼痛和痛敏的病癥。據(jù)研究報(bào)道

2、，神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、皮膚組織損傷性疼痛等多種動(dòng)物模型均可以觀察到雙側(cè)痛敏的現(xiàn)象，大鼠脛骨轉(zhuǎn)移性癌痛模型也出現(xiàn)MIP現(xiàn)象。臨床上，一些嚴(yán)重的慢性疼痛、復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征、截肢及中風(fēng)后遺癥患者亦均可出現(xiàn)MIP，其中，癌痛患者出現(xiàn)的MIP既嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量又干擾了癌癥的治療，是臨床醫(yī)生面臨的棘手問(wèn)題。
　　我課題組根據(jù)中醫(yī)理論創(chuàng)立了具有活血行氣，祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛作用的CQ復(fù)方，其主要成分是川芎嗪和青藤堿，前期的研究工作

3、表明:CQ復(fù)方中的有效成分對(duì)多種神經(jīng)源性疼痛及骨癌痛動(dòng)物模型的鎮(zhèn)痛強(qiáng)度類似于臨床常用的非嗎啡類鎮(zhèn)痛西藥加巴噴丁，機(jī)制研究顯示，其鎮(zhèn)痛效果與抑制紋狀體細(xì)胞外液NE、Glu等神經(jīng)遞質(zhì)的水平有關(guān)。但CQ復(fù)方對(duì)CIP及繼發(fā)性的MIP作用如何，尚不明確。
　　本實(shí)驗(yàn)采用S180肉瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠癌侵襲鏡像痛(Cancer Invasion InducedMirror Image Pain，CIIMIP)模型，觀察CQ復(fù)方對(duì)其的鎮(zhèn)痛作用，檢測(cè)脊

4、髓內(nèi)與疼痛發(fā)生和維持密切相關(guān)的興奮性氨基酸(Excitatory amino acids，EAA)和抑制性氨基酸（Inhibitory amino acids，IAA）的水平、大腦皮質(zhì)內(nèi)內(nèi)源性致痛和鎮(zhèn)痛物質(zhì)的含量及脊髓和血清內(nèi)促炎性細(xì)胞因子含量，探討上述物質(zhì)在CIIMIP發(fā)生和維持及CQ復(fù)方鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，進(jìn)一步觀察NMDA及GABAA受體拮抗劑對(duì)CQ復(fù)方鎮(zhèn)痛作用的影響，探討CQ復(fù)方通過(guò)EAA/IAA發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，為CIIMIP的

5、機(jī)制研究和臨床治療提供參考。
　　研究方法：
　　1、小鼠CIIMIP模型的建立
　　BALB/c雄性小鼠，連續(xù)3d進(jìn)行預(yù)刺激，第4d將雙側(cè)后足機(jī)械縮足閾值(MWT，Mechanical withdrawal threshold)≥0.4g的小鼠隨機(jī)分為正常組(Native)、操作對(duì)照組（Sham）及手術(shù)組(Surgery)。Surgery組于右腿股骨大轉(zhuǎn)子處注射0.2mLS180細(xì)胞液（活細(xì)胞濃度為1×107/mL）

6、，Sham組于相同部位注射等量的滅活的細(xì)胞液，Native組不作任何操作。于術(shù)前及術(shù)后第2-7d測(cè)評(píng)小鼠瘤株接種側(cè)-癌侵襲側(cè)及瘤株接種的對(duì)側(cè)-鏡像側(cè)后足的MWT、癌侵襲側(cè)的自由行走痛及自發(fā)性抬腿次數(shù)。
　　2、動(dòng)物分組給藥及藥效學(xué)評(píng)價(jià)
　　術(shù)后第5-7d連續(xù)3天，將Surgery組雙側(cè)MWT≤0.07g的成模小鼠隨機(jī)分為模型組(Model)、CQ復(fù)方高劑量組(H-CQ，200mg/kg)、CQ復(fù)方中劑量組(M-CQ，150m

7、g/kg)、CQ復(fù)方低劑量組(L-CQ，100mg/kg)及陽(yáng)性對(duì)照-加巴噴丁組（GBP，120mg/kg），術(shù)后第8、9、10d腹腔注射給藥，其中，Native、Sham及Model組均給予等量的生理鹽水，并于給藥前及給藥后30、60、90、120、180、240min等時(shí)間點(diǎn)測(cè)評(píng)癌侵襲側(cè)及鏡像側(cè)后足的MWT。
　　3、神經(jīng)遞質(zhì)、促炎性細(xì)胞因子水平的檢測(cè)
　　末次行為學(xué)測(cè)評(píng)的次日再次給藥45min后，摘眼球取血后脫臼處死小

8、鼠，取其大腦皮質(zhì)及L3-L5段脊髓組織。采用高效液相-熒光法檢測(cè)脊髓組織勻漿液內(nèi)EAA(Glu、Asp)及IAA(GABA、Gly、Tan)的水平;放射免疫法檢測(cè)大腦皮質(zhì)中內(nèi)源性致痛物質(zhì)SP和鎮(zhèn)痛物質(zhì)DynA1-13、β-EP的含量;采用AimPlex流式高通量多因子檢測(cè)技術(shù)分析血清內(nèi)IL-6、MCP-1及脊髓內(nèi)RANTES、MCP-3的含量。4 NMDA及GABAA受體拮抗劑給藥
　　成模小鼠隨機(jī)分為荷包牡丹堿(Bicucull

9、ine，Bic)+CQ復(fù)方組(Bic+CQ)及鹽酸金剛烷胺(Amantadine，Ama)+CQ復(fù)方組(Ama+CQ)兩組，術(shù)后第8天給藥，Bic+ CQ組是在給予CQ復(fù)方15min前尾靜脈注射GABAA競(jìng)爭(zhēng)性受體拮抗劑-Bic2mg/kg，Ama+CQ組是在給予CQ復(fù)方30min前灌胃給予NMDA非競(jìng)爭(zhēng)性受體拮抗劑-Ama200mg/kg。并于-15min（給予Bic前）或-30min（給予Ama前）、0min（腹腔注射CQ復(fù)方前）及

10、給予CQ復(fù)方后30、60、90、120、180、240min等時(shí)間點(diǎn)測(cè)評(píng)癌侵襲側(cè)和鏡像側(cè)后足的MWT，觀察NMDA及GABAA受體拮抗劑對(duì)CQ復(fù)方鎮(zhèn)痛作用的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、小鼠CIIMIP模型的建立
　　造模小鼠癌侵襲側(cè)后足的MWT在術(shù)后第2d開始下降，第4-7d均穩(wěn)定維持在(0.031±0.006) g～(0.057±0.029)g，明顯低于Sham組和Native組(P＜0.05或P＜0.01);鏡

11、像側(cè)后足的MWT亦在術(shù)后第2d開始下降，第4-7d均穩(wěn)定維持在(0.044±0.012) g～(0.101±0.038)g，明顯低于Sham組和Naive組（P＜0.05或P＜0.01）。而模型小鼠左前肢和腹部未見明顯的疼痛表現(xiàn)。
　　2、CQ復(fù)方對(duì)CIIMIP模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用及與加巴噴丁藥效的比較
　　CIIMIP模型小鼠第一次給予CQ復(fù)方后，雙側(cè)的MWT在給藥后30min均開始升高，在30、60min達(dá)藥效高峰。對(duì)癌侵

12、襲側(cè)，H-CQ組在給藥后180min內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MWT較Model組均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，M-CQ組在給藥后60、90min等2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MWT較Model組均顯著升高（P＜0.05）。對(duì)鏡像側(cè)，H-CQ組在觀察的180min內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MWT較Model組均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)，M-CQ組在給藥后30、60、90min等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MWT較Model組均顯著升高（P＜0.05）。連續(xù)給藥3d，

13、CQ復(fù)方對(duì)模型小鼠CIP與MIP的鎮(zhèn)痛作用均略強(qiáng)于單次給藥，但無(wú)顯著性差異。
　　而CIIMIP模型第一次給予加巴噴丁后60、90min達(dá)藥效高峰，且在給藥后觀察的240min內(nèi)所有時(shí)間點(diǎn)對(duì)癌侵襲側(cè)及鏡像側(cè)的MWT較Model組均顯著升高(P＜0.01)。連續(xù)3d給藥，加巴噴丁對(duì)模型小鼠CIP與MIP的鎮(zhèn)痛作用有下降的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。
　　3、CIIMIP小鼠脊髓組織內(nèi)EAA及IAA的含量及CQ復(fù)方對(duì)其的影響
　

14、　與Naive組相比，Model組小鼠L3-L5段脊髓內(nèi)的Glu含量顯著升高(P＜0.05)，Asp無(wú)顯著的變化;而抑制性氨基酸GABA、Gly、Tau含量均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。CQ復(fù)方能顯著抑制模型小鼠脊髓內(nèi)Glu水平（P＜0.05或P＜0.01），升高Gly、GABA及Tau的水平(P＜0.01)，且對(duì)Glu、GABA及Tau含量的影響具有量效依賴關(guān)系。
　　4、NMDA及GABAA受體拮抗劑對(duì)CQ復(fù)方鎮(zhèn)痛

15、作用的影響
　　預(yù)先給予Ama能顯著增強(qiáng)CQ復(fù)方在給藥240min內(nèi)對(duì)CIP的鎮(zhèn)痛作用（P＜0.01或P＜0.05），以及CQ復(fù)方在給藥180min內(nèi)對(duì)MIP的鎮(zhèn)痛作用（P＜0.01或P＜0.05）;預(yù)先給予Bic能部分阻斷CQ復(fù)方在給藥后180min對(duì)CIP的鎮(zhèn)痛作用(P＜0.05)，以及CQ復(fù)方在給藥后180min、240min對(duì)MIP的鎮(zhèn)痛作用(P＜0.05)。
　　5、CIIMIP小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)SP、DynA1-13

16、、β-EP的含量及CQ復(fù)方對(duì)其的影響
　　與Native組相比，Model組小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)內(nèi)源性的致痛物質(zhì)SP含量有顯著性升高(P＜0.01)，內(nèi)源性的鎮(zhèn)痛物質(zhì)DynA1-13顯著降低（P＜0.05），β-EP僅有降低趨勢(shì)，CQ復(fù)方（低、中劑量）能顯著降低SP含量（P＜0.05，P＜0.01），對(duì)DynA1-13、β-EP含量有升高作用，但無(wú)顯著性差異。
　　6、CIIMIP小鼠脊髓組織內(nèi)RANTES、MCP-3的含量及CQ

17、復(fù)方對(duì)其的影響
　　Model組小鼠脊髓內(nèi)的趨化因子RANTES、MCP-3含量較Sham組均顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)，CQ復(fù)方（低、高劑量）能顯著降低模型小鼠脊髓組織內(nèi)RANTES、MCP-3的含量（P＜0.05）。
　　7、CIIMIP小鼠血清內(nèi)IL-6、MCP-1的含量及CQ復(fù)方對(duì)其的影響
　　與Native組相比，Model組模型小鼠血清中的IL-6、MCP-1含量均顯著升高(P＜0.05)，CQ

18、復(fù)方均能顯著降低模型小鼠血清內(nèi)IL-6、MCP-1的含量(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、采用S180細(xì)胞構(gòu)建的CIIMIP模型小鼠鏡像側(cè)的鏡像部位發(fā)生了與CIP趨勢(shì)相同、程度近似的MIP。
　　2、CQ復(fù)方對(duì)CIIMIP模型小鼠CIP及MIP均有明顯鎮(zhèn)痛作用，且具有量效依賴關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)劑量下的CQ復(fù)方的鎮(zhèn)痛效果不及加巴噴丁，但其達(dá)藥效高峰的時(shí)間略早于加巴噴丁。
　　3、CIIMIP模型小鼠脊髓內(nèi)Glu顯

19、著升高，GABA含量顯著降低，CQ復(fù)方可能通過(guò)抑制Glu水平，提高GABA水平，調(diào)節(jié)EAA/IAA平衡，進(jìn)而緩解疼痛。NMDA及GABAA受體拮抗劑對(duì)CQ復(fù)方鎮(zhèn)痛作用影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明:CQ復(fù)方部分通過(guò)NMDA、GABAA受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
　　4、CIIMIP模型小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)SP濃度異常升高、DynA1-13濃度明顯降低，脊髓和血清內(nèi)的IL-6、RANTES、MCP-1、MCP-3等促炎性細(xì)胞因子含量顯著升高，CQ復(fù)方可