脂氧素在大鼠脛骨癌痛中的作用及黃芩素鎮(zhèn)痛機(jī)制研究.pdf

1、癌痛即惡性腫瘤引起的疼痛。因其程度劇烈，難以忍受，嚴(yán)重影響了患者正常工作和生活。其中由原發(fā)性骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌或肺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移至骨所致的疼痛最為常見。目前臨床用于鎮(zhèn)痛的藥物因成癮性或其他毒副作用嚴(yán)重限制了其使用，因此研究并闡明骨癌痛的病理機(jī)制以尋求安全有效緩解疼痛的臨床治療藥物，提高患者生存質(zhì)量勢(shì)在必行。
　　骨癌痛具有獨(dú)特復(fù)雜的病理機(jī)制，至今未能完全闡明。近年來(lái)，結(jié)合國(guó)內(nèi)外及我們實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，骨癌痛的發(fā)生不同于單純的

2、炎癥痛或神經(jīng)痛。在脛骨癌痛大鼠模型上，表現(xiàn)為大鼠脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活增生，脊髓中各種炎性細(xì)胞因子如白介素-1beta(Interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-alfa(Tumor necrosis factor Alfa，TNF-α)表達(dá)上調(diào)，被稱之為神經(jīng)炎癥(Neuroinflammation)，與骨癌痛的發(fā)生密切相關(guān)。此外在對(duì)炎癥痛、神經(jīng)痛和骨癌痛三種病理性疼

3、痛的相關(guān)機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，在骨癌痛模型上脊髓強(qiáng)啡肽(Dynorphin，DYN)陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)顯著增加，抑制其表達(dá)可緩解骨癌痛，提示強(qiáng)啡肽與骨癌痛的發(fā)生密切相關(guān)。
　　生理狀態(tài)下，體內(nèi)存在一整套精密的炎癥調(diào)控系統(tǒng)，通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗炎和致炎兩種力量，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。在急性炎癥期，機(jī)體通過(guò)產(chǎn)生各種抗炎脂類介質(zhì)如脂氧素(Lipoxins，LXs)、Resolvins、Protectins等抑制炎性因子產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥消退。當(dāng)機(jī)體內(nèi)源性產(chǎn)生

4、的抗炎介質(zhì)不足以抵制入侵致炎因子，即轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，遷延不愈，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。脂氧素作為機(jī)體可內(nèi)源性產(chǎn)生的一類抗炎脂類介質(zhì)引起廣泛關(guān)注。脂氧素是一類來(lái)源于花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)經(jīng)一系列脂氧合酶（Lipoxygenases，LOs）代謝產(chǎn)生的具有抗炎和促炎癥消退的脂類介質(zhì)，被譽(yù)為炎癥過(guò)程的“剎車信號(hào)”。根據(jù)其生成途徑及參與調(diào)節(jié)的酶不同，主要包括脂氧素A4(Lipoxin A4，LXA4)、脂氧素B4(Lipo

5、xin B4，LXB4)、阿司匹林誘生型脂氧素A4(Aspirin Triggered Lipoxin A4，ATL)和15-epi-LXB4。脂氧素合成后主要通過(guò)與脂氧素受體（Lipoxin A4 receptor，ALX）結(jié)合，發(fā)揮抗炎和促炎癥消退的作用。研究表明:預(yù)先給予LXA4可顯著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7相關(guān)炎性因子的釋放和大鼠肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥;在足

6、底注射角叉菜膠引起的大鼠炎癥痛模型中，系統(tǒng)及鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物可顯著緩解疼痛，并抑制相關(guān)信號(hào)通路激活;在慢性壓迫性背根神經(jīng)節(jié)損傷(Chronic Compression of DRG，CCD)造成的大鼠神經(jīng)痛模型上，鞘內(nèi)給予LXA4可緩解神經(jīng)痛并抑制炎性因子產(chǎn)生。綜上所述，脂氧素及其類似物在炎癥痛及神經(jīng)痛模型上均能發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用，但是關(guān)于其在骨癌痛中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此探究脂氧素及其類似物是否能夠參與緩解骨癌痛及其相關(guān)分

7、子機(jī)制是本課題的研究?jī)?nèi)容之一。
　　脂氧素主要通過(guò)三種途徑合成:1）通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，主要是多形核粒細(xì)胞(Polymorphonuclear leukocyte，PMN)與血管內(nèi)皮細(xì)胞或氣道上皮細(xì)胞在15-LO和5-LO的參與下生成;2）通過(guò)細(xì)胞與血小板間的相互作用，多形核粒細(xì)胞和血小板在12-LO、5-LO的參與下合成;3）通過(guò)阿司匹林誘導(dǎo)，使環(huán)氧酶-2(COX-2)乙酰化，在5-LO的催化下生成。其中脂氧合酶5-LO、12

8、-LO和15-LO與脂氧素的生成密切相關(guān)。但是這些脂氧合酶不但參與機(jī)體內(nèi)源性抗炎脂類介質(zhì)的產(chǎn)生，與機(jī)體內(nèi)源性致炎脂類介質(zhì)如白細(xì)胞三烯、前列腺素的合成也有密切聯(lián)系。5-LO是白細(xì)胞三烯合成所必須的關(guān)鍵酶。足底注射三種脂氧合酶抑制劑可通過(guò)抑制c-Fos表達(dá)緩解足底注射角叉菜膠引起的大鼠炎癥痛，上調(diào)12/15-LO活動(dòng)誘發(fā)p-ERK顯著激活。以上研究表明，脂氧合酶作為雙刃劍，參與了機(jī)體內(nèi)源性抗炎和致炎脂類介質(zhì)的產(chǎn)生，其異常表達(dá)可能會(huì)打破兩者間

9、平衡導(dǎo)致疾病發(fā)生。
　　中醫(yī)藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù)，尋找具有抗炎鎮(zhèn)痛作用的中藥單體化合物并研究其對(duì)癌痛的鎮(zhèn)痛作用，具有重要理論與實(shí)踐意義。我們注意到對(duì)脂氧合酶具有調(diào)節(jié)作用的一種來(lái)自中藥黃芩的抗炎物質(zhì):黃芩素(Baicalein，BE)。黃芩素是12/15-LO外源性抑制劑，是提取自中藥黃芩的一種黃酮類重要有效成分，分子式C15H10O5，相對(duì)分子質(zhì)量270.24。黃芩，苦、寒，歸肺、脾、胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、

10、降血壓等作用。臨床常用于濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、癰腫瘡毒等。藥理研究表明，黃芩素具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用，主要與其抑制炎性因子表達(dá)、阻斷MEK-ERK信號(hào)通路、降低NF-κB激活等相關(guān)。
　　12/15-LO是參與內(nèi)源性抗炎和致炎脂類介質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，那么在骨癌痛大鼠模型上，脂氧合酶的表達(dá)是否會(huì)發(fā)生變化？外源性給予黃芩素能否發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用？對(duì)內(nèi)源性脂氧合酶有何影響？其發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的具體分子機(jī)制是什么？這是本課題研

11、究的另一內(nèi)容。
　　綜上所述，本課題擬在大鼠脛骨癌痛模型上，從行為學(xué)到形態(tài)學(xué)等不同方面，采用von-FreyHair、Real-Time PCR、免疫熒光法和Western Blot技術(shù)，開展下列研究:1）觀察脂氧素及其類似物在骨癌痛大鼠中的作用及相關(guān)機(jī)制;2）觀察黃芩素對(duì)大鼠骨癌痛的影響、脂氧合酶變化及相關(guān)分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.脂氧素及其類似物提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　1.1骨癌痛大鼠模型建

12、立及評(píng)價(jià)
　　大鼠隨機(jī)分成三組:正常組(Naive)、給予PBS的假手術(shù)組(Sham)和給予腫瘤細(xì)胞的模型組(Cancer)。用von-Frey Hair采用up-and-down方法測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾(PawWithdrawal Threshold，PWT)。結(jié)果顯示:從造模后第三天開始，與Naive組相比，Cancer組術(shù)側(cè)PWT顯著降低，出現(xiàn)痛覺過(guò)敏，伴隨體重下降。X光片及脛骨病理切片也可看到顯著骨質(zhì)破壞。由于骨癌痛大鼠在后期

13、表現(xiàn)為顯著的惡病質(zhì)，伴隨嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞導(dǎo)致拖曳步態(tài)，不利于分子生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)及痛行為的測(cè)定。因此選擇造模后痛閾穩(wěn)定且生理狀態(tài)良好的術(shù)后七到十一天作為主要干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。
　　1.2觀察鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾影響
　　將大鼠隨機(jī)分為五組:Naive、Naive+NS、Naive+LXA40.1μg、Naive+LXB40.1μg和Naive+ATL0.1μg組。測(cè)定基礎(chǔ)痛閾后鞘內(nèi)給藥，在給藥后2、4、6小時(shí)測(cè)痛

14、。結(jié)果顯示:與Naive組相比，鞘內(nèi)給予NS、LXA4、LXB4或ATL對(duì)正常大鼠的機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響。
　　1.3觀察鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾影響
　　造模后，大鼠隨機(jī)分成四組:Cancer+NS、Cancer+LXA40.1μg、 Cancer+LXB40.1μg和Cancer+ATL0.1μg組。造模后第七天，測(cè)痛后鞘內(nèi)給藥，在給藥后2、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+NS組比較，給予LX

15、A4、LXB4或ATL后均可顯著提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾，并以ATL效果最為顯著。因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，以ATL為主，進(jìn)一步探究其對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾影響及相關(guān)機(jī)制。
　　小結(jié):鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物可顯著提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾，以ATL作用最為顯著，但對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響。
　　2.外源性給予ATL通過(guò)ALX提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　2.1 ALX在骨癌痛大鼠脊髓中的表達(dá)和分布
　　將大鼠隨機(jī)分成三組

16、:Naive、Sham和Cancer組。造模后第十一天，將三組大鼠分成兩部分:一部分灌流取材，采用免疫熒光雙標(biāo)法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡掃描觀察，檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b和脂氧素受體標(biāo)記物ALX在大鼠脊髓背角的表達(dá)情況;另一部分新鮮取材，采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)大鼠脊髓脂氧素受體在蛋白水平的表達(dá)變化。免疫熒光法結(jié)果表明:與Naive組相比，在Cancer組，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物

17、GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b在骨癌痛大鼠脊髓背角免疫反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)光密度顯著增強(qiáng)，脂氧素受體標(biāo)記物ALX主要與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP共標(biāo)，少量與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN共標(biāo)，與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b則沒有共標(biāo);Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與Naive組相比，在Cancer組脊髓脂氧素受體的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變。
　　2.2 ATL通過(guò)ALX提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　2.2.1鞘內(nèi)給予ALX拮抗劑BO

18、C-2對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響造模后，將大鼠隨機(jī)分成四組:Cancer+DMSO、Cancer+BOC-210μg、 Cancer+BOC-250μg和Cancer+BOC-2100μg組。造模后第十一天，測(cè)痛后鞘內(nèi)給藥，在給藥后1、2、3、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+DMSO組相比，鞘內(nèi)給予不同劑量BOC-2對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響。因此在下一步實(shí)驗(yàn)采用100μg的BOC-2觀察其對(duì)ATL鎮(zhèn)痛作用的影響。

19、r>　　2.2.2鞘內(nèi)給予ALX拮抗劑BOC-2可拮抗ATL對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用造模后，將大鼠隨機(jī)分成四組:Cancer+DMSO、Cancer+BOC-2100μg、Cancer+ATL0.1μg和Cancer+BOC-2100μg+ATL0.1μg組。造模后第十一天，測(cè)痛后鞘內(nèi)給藥，在給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+DMSO組相比，Cancer+BOC-2100μg組對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾

20、沒有影響，Cancer+ATL0.1μg組可顯著緩解骨癌痛，但Cancer+BOC-2100μg+ ATL0.1μg組則與Cancer+DMSO組無(wú)差異。提示:BOC-2可拮抗ATL緩解骨癌痛的作用。
　　2.3鞘內(nèi)給予不同劑量ATL均可提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾造模后，將大鼠隨機(jī)分為四組:Cancer+NS、Cancer+ATL0.01μg、 Cancer+ATL0.1μg和Cancer+ATL0.15μg組。造模后第十一天，測(cè)痛后

21、鞘內(nèi)給藥，在給藥后2、4、6、8、12小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+NS組相比，給予不同劑量ATL均可緩解骨癌痛，并且隨著劑量增加，鎮(zhèn)痛效應(yīng)增強(qiáng)，鎮(zhèn)痛時(shí)程也有所延長(zhǎng)。
　　2.4鞘內(nèi)給予ATL和嗎啡對(duì)骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的比較
　　造模后，將大鼠隨機(jī)分成四組:Cancer+NS、Cancer+Morphine0.1μg、Cancer+Morphine5μg和Cancer+ATL0.1μg組。造模后第十一天，測(cè)痛后鞘內(nèi)給藥

22、，并在給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+NS組相比，鞘內(nèi)給予5μg嗎啡鎮(zhèn)痛效果較強(qiáng);鞘內(nèi)給予0.1μg ATL和嗎啡均可緩解骨癌痛，其中嗎啡出現(xiàn)鎮(zhèn)痛高峰較早，但是ATL作用更為持久。
　　2.5尾靜脈給予不同劑量ATL提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　造模后，將大鼠隨機(jī)分成三組:Cancer+NS、Cancer+ATL10μg/kg和Cancer+ATL40μg/kg組。造模后

23、第十一天，測(cè)痛后尾靜脈給藥，并在給藥后1、2、3、4、6、8、12小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果顯示:與Cancer+NS組相比，系統(tǒng)給予不同劑量ATL均能緩解骨癌痛，并且以40μg/kg的大劑量組鎮(zhèn)痛效果更為顯著。
　　小結(jié):與對(duì)照組相比，在模型組脂氧素受體表達(dá)無(wú)顯著改變;脂氧素受體在脊髓背角主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞，少量分布于神經(jīng)元;在模型組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b表達(dá)顯著增加，但是脂氧素受體標(biāo)記物AL

24、X沒有顯著改變。鞘內(nèi)給予脂氧素受體拮抗劑BOC-2可拮抗ATL緩解骨癌痛，提示ATL發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用是通過(guò)ALX。鞘內(nèi)及尾靜脈給予不同劑量ATL均能緩解骨癌痛，隨劑量增加，鎮(zhèn)痛效果隨之增強(qiáng);與鞘內(nèi)給予相同劑量嗎啡相比，ATL鎮(zhèn)痛作用更為持久。
　　3.ATL提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾的相關(guān)機(jī)制研究
　　3.1鞘內(nèi)給予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)
　　將大鼠隨機(jī)分成三組:Naive、Cancer+NS和Cancer+

25、ATL0.1μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥，給藥后2小時(shí)，動(dòng)物新鮮取材，選取脊髓L4-L6節(jié)段，進(jìn)行Real-TimePCR實(shí)驗(yàn)。觀察大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與Naive組相比，在Cancer+NS組IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)。給予ATL后抑制IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)。
　　3.2鞘內(nèi)給予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓MAPK信號(hào)通路激活

26、r>　　大鼠造模后隨機(jī)分成五組:Naive、Sham、Cancer、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥，給藥后兩小時(shí)，動(dòng)物新鮮取材，選取脊髓L4-L6節(jié)段，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。觀察脊髓中p-ERK、p-p38、p-JNK、p-STAT3、SOCS1、SOCS2和SOCS3表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1）與Naive組相比，在Cancer組p-ERK、p-p38、p-JNK和p-STA

27、T3表達(dá)上調(diào)，SOCS1、SOCS2和SOCS3表達(dá)無(wú)顯著改變;2）與Cancer+NS組相比，給予ATL后p-ERK、p-p38和p-JNK的上調(diào)被抑制，但p-STAT3表達(dá)無(wú)顯著改變。
　　3.3鞘內(nèi)給予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓前強(qiáng)啡肽原mRNA上調(diào)將大鼠隨機(jī)分成三組:Naive、 Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥，給藥后2小時(shí)，動(dòng)物新鮮取材，選取脊髓L4-L6節(jié)段，采用高通量Re

28、al-Time PCR檢測(cè)脊髓中前強(qiáng)啡肽原(Preprodynorphin，PPD)mRNA表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與Naive組相比，在Cancer+NS組，PPD mRNA的表達(dá)上調(diào)，給予ATL后可抑制其上調(diào)。
　　3.4鞘內(nèi)給予ATL抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-LO和15-LO表達(dá)大鼠造模后隨機(jī)分成五組:Naive、Sham、Cancer、Cancer+NS和Cancer+ATL0.1μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥，給藥后兩

29、小時(shí)，動(dòng)物新鮮取材，選取脊髓L4-L6節(jié)段，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:1）與Naive組相比，在Cancer組大鼠脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO表達(dá)上調(diào);2）與Cancer+NS組相比，給予ATL后，可抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-LO和15-LO的表達(dá)，但是對(duì)12-LO的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　小結(jié):在骨癌痛大鼠模型上，脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)增加;MAPK和S

30、TAT3信號(hào)通路磷酸化水平升高;脊髓前強(qiáng)啡肽原mRNA表達(dá)升高;脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO的表達(dá)增加。鞘內(nèi)給予ATL可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào);抑制MAPK信號(hào)通路磷酸化;抑制脊髓前強(qiáng)啡肽原mRNA表達(dá)和脂氧合酶5-LO、15-LO表達(dá)。
　　4.黃芩素對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾影響及相關(guān)機(jī)制研究
　　4.1系統(tǒng)及鞘內(nèi)給予黃芩素對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響
　　將

31、大鼠隨機(jī)分成四組:Naive+DMSO i.t.、Naive+BE100μg/i.t.、Naive+DMSO i.p.和Naive+BE300 mg/kg/i.p.組。在給藥后0.5、1、2、3、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，系統(tǒng)及鞘內(nèi)給予黃芩素對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響。
　　4.2鞘內(nèi)及系統(tǒng)給予黃芩素可提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　4.2.1鞘內(nèi)給予黃芩素可提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　大鼠造模后隨機(jī)分成四

32、組:Cancer+DMSO、Cancer+BE10μg、Cancer+BE50μg和Cancer+BE100μg組。造模后第十一天，測(cè)痛后鞘內(nèi)給藥。在給藥后0.5、1、2、3、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果表明:鞘內(nèi)給予100μg黃芩素可緩解骨癌痛，持續(xù)至給藥后4小時(shí)。
　　4.2.2系統(tǒng)給予黃芩素可提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾
　　大鼠造模后隨機(jī)分成三組:Cancer+DMSO、Cancer+BE150 mg/kg和Cancer+BE30

33、0 mg/kg組。造模后第十一天，測(cè)痛后腹腔給藥。在給藥后0.5、1、2、3、4、6小時(shí)測(cè)痛。結(jié)果表明:在給藥后兩小時(shí)，給予300 mg/kg黃芩素可緩解骨癌痛。
　　4.3黃芩素提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾的相關(guān)機(jī)制研究
　　4.3.1鞘內(nèi)給予黃芩素抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子表達(dá)
　　將大鼠隨機(jī)分成三組:Naive、Cancer+DMSO和Cancer+BE100μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥，給藥后兩小時(shí)新鮮取材，

34、選取脊髓L4-L6節(jié)段，用Real-Time PCR檢測(cè)大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明:與Naive組相比，在Cancer+DMSO組，脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。給予黃芩素后可抑制IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)。
　　4.3.2鞘內(nèi)給予黃芩素對(duì)骨癌痛大鼠脊髓相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　大鼠造模后隨機(jī)分成兩組:Cancer+DMSO和Canc

35、er+BE100μg組。造模后第十一天，鞘內(nèi)給藥。給藥后2小時(shí)，動(dòng)物新鮮取材，選取脊髓L4-L6節(jié)段，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)大鼠脊髓磷酸化MAPK和STAT3信號(hào)通路表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與Cancer+DMSO組相比，給予黃芩素后可抑制p-p38和p-JNK的激活，但對(duì)p-ERK和p-STAT3表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　4.3.3鞘內(nèi)給予黃芩素抑制骨癌痛大鼠脊髓脂氧合酶5-LO的表達(dá)大鼠分組及干預(yù)同上，用Western B

36、lot技術(shù)檢測(cè)大鼠脊髓脂氧合酶5-LO、12-LO和15-LO表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與Cancer+DMSO組相比，給予黃芩素后可抑制脂氧合酶5-LO的表達(dá)，但對(duì)脂氧合酶12-LO和15-LO表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　小結(jié):在骨癌痛大鼠，鞘內(nèi)及系統(tǒng)給予黃芩素可緩解骨癌痛，對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響。在骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β、 IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào);MAPK、STAT3信號(hào)通路磷酸化水平升高;脊髓脂氧合酶5

37、-LO、12-LO和15-LO表達(dá)上調(diào)。鞘內(nèi)給予黃芩素后，可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，抑制p-p38和p-JNK的激活，抑制脂氧合酶5-LO表達(dá)上調(diào)。
　　綜上所述，本研究提示:
　　1.鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物可提高骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾，并以ATL效果更好，對(duì)正常大鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響;
　　2.脂氧素受體在脊髓背角主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞，少量分布于神經(jīng)元，與對(duì)照組相比在模

38、型上受體的表達(dá)無(wú)顯著改變;鞘內(nèi)預(yù)先給予脂氧素受體拮抗劑BOC-2可阻斷ATL緩解骨癌痛的作用，提示ATL發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用是通過(guò)與脂氧素受體結(jié)合;鞘內(nèi)及系統(tǒng)給予不同劑量ATL均可緩解骨癌痛;
　　3.鞘內(nèi)給予ATL可抑制骨癌痛大鼠脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)，抑制p-ERK、p-p38和p-JNK激活，抑制與中樞敏化密切相關(guān)的內(nèi)阿片肽前強(qiáng)啡肽原mRNA表達(dá)，抑制脊髓脂氧合酶5-LO和12-LO表達(dá)。提示ATL可能