CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。在卵巢癌中,最為常見的病理類型是上皮性卵巢癌。在發(fā)達國家,上皮性卵巢癌是致死率最高的婦科腫瘤,超過70%的婦女在被診斷時就已經(jīng)是晚期,而晚期卵巢癌的治愈率不高于30%。上皮性卵巢癌的治療效果不佳,與其在診斷之前腫瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。到目前為止,上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制仍然不完全清楚。所以尋找上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,研究其轉(zhuǎn)移機制,一直是卵巢癌研究中的熱點。
  囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是一個約170 kDa的糖蛋白,是一個環(huán)磷酸腺苷依賴的氯離子通道蛋白。CFTR分布于人類各組織的上皮細胞,包括女性生殖道,通過調(diào)控離子和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運,在維持和穩(wěn)定機體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CFTR是ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運蛋白家族的一員,它們利用ATP酶轉(zhuǎn)運底物通過細胞膜,這與多

3、種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。CFTR的基因突變可以導(dǎo)致其在細胞膜上轉(zhuǎn)運功能的障礙,可能增加或減少一些惡性腫瘤患病風(fēng)險。腫瘤類型不同,CFTR能夠促進或抑制腫瘤的發(fā)生。還有研究表明,CFTR與乳腺癌的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。CFTR也與一些細胞炎癥和凋亡相關(guān)的信號通路有關(guān)。國內(nèi)外目前尚無CFTR在上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的相關(guān)研究報道。因此,本課題將分為以下三部分對CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其潛在的機制進行初步研究。

4、>  第一部分.CFTR在人上皮性卵巢癌中的表達及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性
  目的:檢測人上皮性卵巢癌組織、良性卵巢組織及正常卵巢組織標(biāo)本中CFTR的蛋白表達情況,探討上皮性卵巢癌組織中CFTR的表達與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
  方法:
 ?。?)采用免疫組織化學(xué)法檢測CFTR在83例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本,18例良性腫瘤標(biāo)本和11例正常卵巢組織標(biāo)本中的表達情況。
  (2)分析CFTR的表達與臨床病理參數(shù)之間

5、的關(guān)系。
  結(jié)果:
  免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,CFTR在上皮性卵巢癌組織中的表達比良性卵巢腫瘤組(P<0.05)以及正常卵巢組(P<0.05)均明顯增高,異均有統(tǒng)計學(xué)意義,而良性卵巢腫瘤和正常卵巢組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在上皮性卵巢癌中,CFTR蛋白的表達水平在FIGOⅢ/Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ/Ⅱ期(P<0.05),病理分級2-3級組織中的表達顯著高于1級(P<0.05),血漿Ca-125>35U/ml的組織

6、中表達顯著高于Ca-125<35U/ml的組織(P<0.05),但與患者年齡、腫瘤大小、血漿HE4水平無關(guān)(P>0.05)。在各個病理類型中,漿液性囊腺癌中CFTR的表達水平比粘液性囊腺癌(P<0.05)和子宮內(nèi)膜樣癌(P<0.05)高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)論:在上皮性卵巢癌組織中CFTR高表達。高水平的CFTR與上皮性卵巢癌分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值有關(guān),CFTR的高表達可能與臨床不良預(yù)后有關(guān)。在卵巢漿液性囊腺癌

7、組織中,CFTR的表達水平比其他病理類型高,這可能說明 CFTR在漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
  第二部分.CFTR基因特異性shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細胞株的篩選及人CFTR基因重組腺病毒的包裝及鑒定
  目的:應(yīng)用人CFTR基因特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)真核質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞,嘌呤霉素篩選,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌細胞株,并檢測驗證。構(gòu)建包含人CFTR基因的重組腺病毒真核表達載體,使用HEK293

8、細胞包裝重組腺病毒。利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株和重組腺病毒,為后續(xù)研究奠定實驗基礎(chǔ)。
  方法:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌法擴增CFTR基因特異性shRNA表達質(zhì)粒,并酶切鑒定。將shRNA質(zhì)粒通過PolyJet?轉(zhuǎn)染到A2780、SKOV3細胞中,對轉(zhuǎn)染后細胞進行嘌呤霉素加壓篩選,熒光顯微鏡觀察后,挑選克隆,擴大培養(yǎng),直至建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。采用Western blot法分別檢測轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及未轉(zhuǎn)染組細胞中CFTR蛋白表達量的變化,驗

9、證和篩選CFTR基因抑制效應(yīng)最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
  將目的片段人CFTR基因酶切、分離、純化。構(gòu)建pAdTrace-CFTR-TOX載體并酶切及測序鑒定。利用BJ5183細菌行質(zhì)粒pAdTrace-CFTR的同源重組,然后酶切及PCR法鑒定。將同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞,進行病毒的包裝和擴增,乒乓感染法制備高滴度Ad-CFTR腺病毒,熒光顯微鏡觀察。行Western blot檢測病毒感

10、染后卵巢癌細胞CFTR蛋白表達水平。
  結(jié)果:經(jīng)酶切驗證,成功擴增CFTR特異性shRNA表達質(zhì)粒。將CFTR-shRNA-1, CFTR-shRNA-2, CFTR-shRNA-3, CFTR-shRNA-4和陰性對照成功轉(zhuǎn)染A2780、SKOV3細胞,嘌呤霉素霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達的單克隆細胞株。熒光顯微鏡觀察細胞克隆的GFP表達,成功驗證和篩選有均勻GFP熒光的細胞克隆。通過Western blot法檢測CFTR蛋白表達

11、,驗證和篩選CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細胞株A2780-CFTRi2和SKOV3-CFTRi3細胞。
  經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳鑒定表明目的人CFTR基因分離成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳及基因測序表明重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR-TOX構(gòu)建成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳、PCR檢測表明同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR構(gòu)建成功。熒光顯微鏡觀察,HEK293細胞RFP表達,表明Ad-CFTR腺病毒包裝及擴增成功。熒

12、光顯微鏡觀察Ad-CFTR腺病毒感染卵巢癌細胞效率,western blot分析表明腺病毒Ad-CFTR感染后細胞CFTR蛋白表達增加,說明重組腺病毒Ad-CFTR構(gòu)建成功。
  結(jié)論:成功擴增和鑒定了CFTR基因的特異性重組質(zhì)粒。利用細胞轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素成功篩選獲得了CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細胞株。利用pAdEasy系統(tǒng)成功構(gòu)建重組腺病毒真核表達載體pAdTrace-CFTR-TOX,成功包裝獲得過表達人C

13、FTR基因的腺病毒,為進一步研究CFTR惡性生物學(xué)行為及其分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。
  第三部分.CFTR參與調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移行為及機制的實驗研究
  目的:探討CFTR對卵巢癌A2780、SKOV3細胞侵襲、遷移、增殖和粘附等一系列惡性生物學(xué)行為的影響及其可能分子機制。
  方法:Transwell小室實驗檢測CFTRi細胞的遷移、侵襲能力變化。劃痕實驗檢測CFTR過表達細胞遷移能力的變化。細胞粘附實驗分

14、析CFTRi細胞的粘附能力改變。細胞增殖實驗測定CFTRi細胞增殖能力改變。平板克隆形成實驗觀察CFTRi細胞的克隆形成能力變化。裸鼠皮下移成瘤實驗觀察CFTRi細胞體內(nèi)成瘤能力變化,HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化。重組腺病毒Ad-CFTR感染卵巢癌細胞A2780、SKOV3后,Western blot法檢測細胞src通路蛋白表達及其磷酸化形式的水平變化。
  結(jié)果:
 ?。?)Transwell小室遷移實驗結(jié)果表明,

15、CFTRi細胞的遷移能力受到抑制。
  與對照組相比,約有63.11%的A2780-CFTRi細胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比,遷移能力減少了41.72%。
 ?。?)Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示,CFTRi細胞的侵襲能力受到抑制。
  與對照組相比,約有63.93%的A2780-CFTRi細胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比,侵襲能力減少了60.89%

16、。
 ?。?)細胞劃痕實驗結(jié)果表明,Ad-CFTR感染后細胞遷移能力增加。
  A2780-Ad-CFTR組比對照組遷移能力增加了39.5%,同樣的,SKOV3-Ad-CFTR組遷移程度比對照組增加39.3%。
 ?。?)細胞粘附實驗顯示,CFTRi細胞的粘附能力顯著降低。
  A2780-CFTRi細胞株粘附能力降低了約38.52%,而SKOV3-CFTRi粘附能力減少了42.31%。
 ?。?)細胞增殖

17、實驗顯示出了CFTRi細胞增殖能力的降低。
  A2780?CFTRi和SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比均表現(xiàn)出增殖能力的降低。
 ?。?)平板克隆形成實驗表明,CFTRi表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。
  A2780?CFTRi和SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比均表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。
 ?。?)裸鼠皮下移成瘤實驗發(fā)現(xiàn),CFTRi細胞移植瘤瘤體生長速度緩慢,體積減小,移植瘤重量減少。HE染色

18、發(fā)現(xiàn)CFTRi組移植瘤細胞排列相對整齊。
 ?。?)各組細胞總的c-Src和磷酸化-Src419(Tyr419)表達量的變化均沒有統(tǒng)計學(xué)意義,CFTR過表達的組細胞表現(xiàn)出了磷酸化-Src530(Tyr530)的激活。
  結(jié)論:CFTRi卵巢癌細胞表現(xiàn)出了細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力和克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力的顯著抑制,Ad-CFTR感染后細胞表現(xiàn)出了遷移能力的增加,從正反兩方面證實了CFTR在上皮性卵巢癌侵襲遷移、增殖、

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