Id蛋白對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分
　　目的:研究Id蛋白家族各因子在喉鱗癌中蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況,探討Id1與微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLVD)的關(guān)系,以及其與喉鱗癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:應(yīng)用組織芯片和免疫組化技術(shù)檢測了100例喉癌組織樣點(diǎn)(原發(fā)癌80例,轉(zhuǎn)移癌20例)中Id蛋白家族個(gè)因子在蛋白水平的表達(dá),同時(shí)以新生血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物C

2、D105和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-1分別量化腫瘤內(nèi)的微血管和微淋巴管,標(biāo)記微血管密度(MVD)和微淋巴管密度(MLVD),結(jié)合臨床資料對(duì)喉鱗癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分析。以RT-PCR檢測了Id蛋白家族基因和其它相關(guān)基因——p21,TIMP-2,THBS-1,VEGF,VEGF-c在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。
　　結(jié)果:CD105在癌巢邊緣的MVD強(qiáng)于中央,其標(biāo)記的MVD與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),并且在原發(fā)癌組織,轉(zhuǎn)移癌和正

3、常組織中表達(dá)差異有顯著性(P<0.05)。MLVD與喉鱗癌的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)Id1陰性組和陽性組比較,其MVD和MLVD的差異有顯著性(P=0.048,P=0.034)。且在喉鱗癌的組織分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中也有顯著差異(P分別為0.0301,0.006,0.0455和0.0041)。Id2-4在人喉鱗狀細(xì)胞癌中未見明顯表達(dá)。在喉鱗癌中,Id1基因mRNA表達(dá)增高,Id2,Id3有表達(dá),但有正常粘膜相比差異無顯著性(P<0.05)。Id4

4、在正常粘膜和喉癌組織均未檢測到有意義的表達(dá)。p21基因未見表達(dá),TIMP-2基因的表達(dá)無顯著性差異,THBS-1下調(diào),VEGF,VEGF-C基因表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分
　　目的:探討Id1基因在Hep-2細(xì)胞系的表達(dá)情況,以及Id1基因在抗腫瘤藥物淫羊藿甙干預(yù)中的作用。
　　方法:收集12.5mg/l,25mg/l,50mg/l,100mg/l淫羊藿甙處理48h后的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,RT-PCR檢測Id1mRNA及C

5、D105,LYVE-1,p21,TIMP-2,VEGF-C,THBS-1,VEGF mRNA在淫羊藿甙干預(yù)前后的變化情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測Hep-2細(xì)胞周期在淫羊藿甙干預(yù)下的變化。MTT法測不同濃度梯度的淫羊藿甙(分別為6.25mg/l,12.5mg/l,25mg/l,50mg/l,100mg/l,200mg/l,400mg/l)處理后Hep-2細(xì)胞增殖的變化,軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)測試 Hep-2細(xì)胞用藥前后非錨定依賴性生長力的變化,細(xì)胞基質(zhì)黏

6、附試驗(yàn)測試用藥前后Hep-2細(xì)胞和基質(zhì)的黏附能力,Transwell小室測定用藥前后Hep-2細(xì)胞侵襲力的變化。
　　結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳分析各處理組Id1基因mRNA的條帶隨淫羊藿甙濃度的增加而逐漸變窄,強(qiáng)度減弱,而P21基因mRNA表達(dá)上調(diào),且有明顯的濃度依賴性。淫羊藿甙干預(yù)后,CD105 mRNA表達(dá)水平減低,LYVE-1 mRNA表達(dá)水平減低,THBS-1的表達(dá)水平上調(diào),VEGF,VEGF-C mRNA表達(dá)水平無明顯差異。

7、ICA25mg/L處理Hep-2細(xì)胞48h,與對(duì)照組比較,細(xì)胞周期各時(shí)相分布中S期較對(duì)照組明顯減小(P=0.001),而G0/G1期較對(duì)照組升高(P=0.0025),G2/M期無顯著變化(P=0.0637)。同時(shí),ICA處理后,Hep-2細(xì)胞G0/G1峰左移,提示ICA處理組的Hep-2細(xì)胞非整倍體的DNA有可能減少。通過不同梯度的動(dòng)態(tài)觀察,在濃度6.25mg/l~100mg/l范圍內(nèi),抑制作用呈明顯的濃度依賴效應(yīng)和時(shí)間依賴效應(yīng),48h

8、后時(shí)間依賴性減弱。100mg/l,200mg/l,和400mg/l處理組之間無顯著性差異(均為P>0.05)。ICA處理48h的IC50為34mg/l。與對(duì)照組相比,淫羊藿甙處理Hep-2細(xì)胞48h后有侵襲力減弱,且與濃度有依賴關(guān)系,ICA50mg/l,100mg/l處理48h后仍貼壁的Hep-2細(xì)胞-基質(zhì)黏附能力明顯下降,黏附率分別為33.5％,21.6%(P<0.05,P<0.01)。ICA50mg/L,100mg/l處理Hep-2