人源基因載體和自體成肌細(xì)胞介導(dǎo)DMD基因治療的初步研究.pdf

1、杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種嚴(yán)重的X連鎖隱性遺傳的致死性疾病。其發(fā)病機(jī)制是由于DMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin蛋白缺失或功能喪失所致。至今臨床上尚無有效的方法治療DMD，基因治療的興起，為從根本上徹底治療該病帶來了希望。采用載體攜帶的外源DMD基因，通過in vivo或ex vivo的途徑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是基因治療DMD最常用的策略。病毒載體由于在轉(zhuǎn)染中體現(xiàn)出來的優(yōu)勢，成為目前研究中被廣泛采用的載體。然而，病毒載體存在的一些不可避

2、免的缺陷(如容量有限、免疫原性、可能導(dǎo)致的插入性突變等)限制了其在DMD基因治療中的進(jìn)一步應(yīng)用。 對于DMD這樣的遺傳性疾病而言，基因治療的最終目標(biāo)是要通過一次簡單、可行、安全、有效的方法，能夠使基因轉(zhuǎn)移后的外源基因獲得長期和穩(wěn)定的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，我室長期以來一直致力于研究一種新型的非病毒基因治療載體一人源基因載體。前期的研究已經(jīng)表明，該載體能將外源基因定點(diǎn)整合到人纖維肉瘤細(xì)胞株(HTl080)基因組中的rDNA區(qū)，并能

3、使外源基因有效表達(dá)。為了進(jìn)一步應(yīng)用人源基因載體進(jìn)行DMD等遺傳病的治療，我室設(shè)計(jì)了一條“體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移”的策略。依照這一策略，我們需要從病人自身選擇合適的靶細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)，然后通過構(gòu)建攜帶治療基因的人源基因載體對培養(yǎng)的成體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，并通過篩選獲得定點(diǎn)整合的細(xì)胞克隆用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 本研究圍繞著我室制定的這一策略以及前期工作遇到的一些問題展開。首先，從1例基因診斷明確的DMD患者的腓腸肌取材，分離和培養(yǎng)成肌細(xì)胞。通過連

4、續(xù)傳代的形態(tài)學(xué)觀察、desmin免疫熒光染色、生長曲線繪制、低溫凍存與復(fù)蘇、不同代次核型分析以及體外致瘤性實(shí)驗(yàn)等初步研究了DMD病人成肌細(xì)胞的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功地從病人肌組織中分離和培養(yǎng)出了成肌細(xì)胞，該細(xì)胞可成為利用人源基因載體進(jìn)行“體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移”策略的合適的靶細(xì)胞。同時，我們對基因轉(zhuǎn)移所需的相關(guān)載體進(jìn)行了大量抽提，酶切鑒定后，利用這些載體轉(zhuǎn)染了COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后可觀察到minidystrophin-EGFP融合蛋白

5、能準(zhǔn)確定位到細(xì)胞膜處，可能具有正常的生物學(xué)功能。其次，為了盡可能地提高人源基因載體在成肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，我們以攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的人源基因載體(pHrnG)為報告載體，采用了電穿孔、脂質(zhì)體、FuGENE 6和細(xì)胞核轉(zhuǎn)染 4 種轉(zhuǎn)染方法對成肌細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。初步的結(jié)果表明，在 4 種方法中，細(xì)胞核轉(zhuǎn)染和FuGENE 6的轉(zhuǎn)染方式具有相對較高的轉(zhuǎn)染效率，在優(yōu)化和完善的基礎(chǔ)上，可適用于對成肌細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。上述的研究結(jié)果，為進(jìn)一步利