肝干細胞作為肝細胞癌靶向基因治療載體的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達外源標(biāo)記基因的工程化肝干細胞,在體外共培養(yǎng)體系及動物體內(nèi)移植實驗中觀察標(biāo)記肝干細胞對肝癌細胞的定向趨向能力,初步探討以肝干細胞作為肝細胞癌靶向基因治療載體的可行性。 方法:1.采用細菌同源重組法構(gòu)建增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因腺病毒載體pAd-CMV-EGFP,在人胚腎293細胞中包裝制備腺病毒,并用重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的大鼠肝干細胞WB-F344,觀察腺病毒攜帶的外源基因EGFP在WB-F34

2、4細胞中的表達及對肝干細胞的感染效率。單克隆培養(yǎng)純化建立穩(wěn)定表達EGFP的細胞株(WB-EGFP),并采用流式細胞術(shù)、免疫細胞化學(xué)技術(shù)、誘導(dǎo)分化實驗以觀察其生物學(xué)特性。2.利用重組腺病毒介導(dǎo)EGFP在大鼠肝干細胞WB-F344和原代培養(yǎng)的胚胎成纖維細胞中表達,建立工程化穩(wěn)定表達EGFP的肝干細胞WB-EGFP、大鼠胚胎成纖維細胞REF-EGFP。在相互隔離的條件下,共培養(yǎng)肝癌細胞CBRH7919和肝干細胞WB-EGFP或成纖維細胞REF

3、-EGFP,連續(xù)動態(tài)觀察肝干細胞在共培養(yǎng)體系中遷移的生物學(xué)行為,以探討肝干細胞是否有趨向肝癌細胞的特性。3.將肝癌細胞CBRH7919在免疫抑制的Wistar大鼠肝臟原位注射,建立大鼠肝癌原位動物模型,從尾靜脈注射EGFP標(biāo)記的肝干細胞,不同時點取大鼠肝癌、癌旁肝組織、正常肝組織、脾臟、腎臟以及肺臟組織標(biāo)本,動態(tài)追蹤肝干細胞在體內(nèi)的遷移,并用免疫組織化學(xué)染色證實c-kit陽性細胞的分布。免疫組織化學(xué)染色法,分析SDF-1、c-kit在正

4、常肝組織和肝癌組織中的表達差異。進一步,經(jīng)門靜脈、肝動脈、尾靜脈、癌旁肝組織等四種不同的途徑移植肝干細胞,觀察分析不同移植途徑對肝干細胞趨向肝癌及肝癌組織內(nèi)定植、增殖能力的影響。 結(jié)果:1.成功構(gòu)建腺病毒載體,包裝制備出高滴度的重組腺病毒Ad-EGFP。重組腺病毒能有效感染肝干細胞WB-F344,感染率約40~70%。單克隆培養(yǎng)建立WB-EGFP細胞株,觀察直觀,連續(xù)傳代8~9代均較穩(wěn)定表達EGFP及肝干細胞表面標(biāo)記,仍保持干細

5、胞樣的增殖、分化等基本生物學(xué)特性。2.成功建立穩(wěn)定表達EGFP的大鼠肝干細胞(WB-EGFP)、胚胎成纖維細胞(REF-EGFP)。在肝干細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)體系中,觀察到隔離區(qū)細胞爬片上培養(yǎng)的WB-EGFP細胞緩慢向肝癌細胞CBRH7919生長區(qū)移動,不僅發(fā)生在中央隔離空白區(qū)接種的WB-EGFP細胞,而且最邊緣空白區(qū)接種的WB-EGFP細胞也有類似的定向遷移;而胚胎成纖維細胞無趨向肝癌細胞遷移的現(xiàn)象,72小時后仍大部分停留在蓋玻片上。

6、兩種細胞向肝癌細胞定向遷移的細胞數(shù)量有明顯差異(P<0.01)。3.建立大鼠肝癌模型,經(jīng)尾靜脈移植分子標(biāo)記的肝干細胞,動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)肝癌組織邊緣出現(xiàn)明顯的綠色熒光細胞環(huán)繞,熒光細胞逐漸擴散到肝癌組織中,甚至到達腫瘤中央?yún)^(qū)域。而癌旁肝組織、對照組正常肝臟、脾臟、腎臟以及肺臟中,均無明確的熒光細胞分布。免疫組化分析,肝癌組織中c-kit陽性細胞明顯增多(P<0.001),SDF-1表達與正常肝組織比較無明顯升高(P>0.05),肝干細胞這種定

7、向遠距離遷移至腫瘤的分子機理與趨化因子SDF-1的表達可能無確切相關(guān)關(guān)系。不同移植途徑對肝干細胞的體內(nèi)分布有影響,四種移植途徑中,門靜脈途徑更有利于肝干細胞定向遷移至肝癌瘤床,并迅速在腫瘤組織中定植、增殖(P<0.05),部分替代并整和腫瘤組織。同時肝干細胞在體內(nèi)仍穩(wěn)定表達外源標(biāo)記基因產(chǎn)物。 結(jié)論:利用重組腺病毒能有效地介導(dǎo)外源基因在肝干細胞中穩(wěn)定表達,不影響其干細胞的生物學(xué)特性。肝干細胞可作為基因治療的載體攜帶目的基因,同時標(biāo)

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