打頂前后煙草miRNA表達譜的生物信息學分析及靶基因的電子克隆.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是調(diào)控基因表達的重要因子。參與植物整個生長發(fā)育進程的調(diào)控。大多數(shù)miRNAs的靶基因是編碼調(diào)控蛋白的基因，說明miRNAs是植物中主要的調(diào)控因子，處于基因表達調(diào)控的中心位置。不同家族miRNAs在植物體內(nèi)的差異表達顯著，它們或廣泛表達，或僅在特異的組織表達，或在特定的發(fā)育時期表達；并且，在不同層次上（轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯等）對靶基因進行調(diào)控。煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，打頂是煙草栽培種的一種重要農(nóng)藝措施，煙

2、株打頂后煙堿合成能力增強的原因一直是煙草科技工作者致力研究的焦點問題。為了研究煙株打頂后，根系合成煙堿能力變化的調(diào)控機制，我們采用對打頂前、后煙株根尖組織中的miRNAs進行了深度測序，獲得了相應的表達譜。本文利用生物信息學方法對其表達譜進行了分析，同時分析了與煙堿合成相關的氮素代謝關鍵酶GS2，結果如下：
　　 1、將測序得到的小分子RNA(SmallRNA，sRNA)序列進行分類注釋，獲得樣品中包含的各組分及表達量信息，經(jīng)過

3、樣品間公共序列分析，在宏觀上顯示了煙草smallRNA的特征及表達變化。打頂前后小分子RNA序列核苷酸長度分布情況顯示，打頂前、后均發(fā)現(xiàn)3個峰值，分別在21nt22nt和24nt處，這與smallRNA現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)相吻合，在打頂后，長度短于20個核苷酸的smallRNA數(shù)量要多于打頂前，而在打頂前，長度大于等于20個核苷酸的smallRNA數(shù)量要多于打頂后，并且打頂前24nt的smallRNA數(shù)量要高于打頂后smallRNA數(shù)量的30

4、％。樣品間共有序列在總smallRNA表達數(shù)量中占到了60.96％，但是在非冗余分布中占9.56％，這說明共有smallRNA序列是調(diào)控煙株正常生長發(fā)育過程的基礎smallRNA。無論打頂前、后，rRNA和tRNA始終占除miRNA外4種非編碼小RNA總量的99％，snRNA和snoRNA所占的比例不足1％;打頂前rRNA的含量高于tRNA，打頂后則相反。這種現(xiàn)象可能與rRNA、tRNA參與蛋白質(zhì)合成步驟有關。
　　 2、找到和

5、miRBase完全匹配的miRNA數(shù)量246條；打頂后表達量明顯上升的miRNA12條，其中有8條表達量升高20倍以上，最高的達到了4500多倍；打頂后表達量明顯下降的miRNA12條，有7條miRNA表達量不足打頂前的25％，下降幅度最大的miRNA表達量不足打頂前1％;打頂后表達量無明顯變化的有9條；打頂前特異miRNA4條，打頂后特異miRNA4條；利用生物信息學方法，把那些在數(shù)據(jù)庫中沒有任何注釋的小分子RNA根據(jù)miRNA候選發(fā)

6、夾狀結構的上游高度保守的模序、酶切位點的保守性、發(fā)夾前體折疊自由能能量等結構特征進行了預測和搜索，并分析其二級結構特征，發(fā)現(xiàn)煙草中未報道的miRNA的候選分子56個。
　　 3、電子克隆了miRNA164的靶基因：經(jīng)網(wǎng)上資料查詢，得到miRNA164的靶基因NAC，采用電子克隆方法得到了煙草中NAC-like基因的cDNA序列(1348bp)。并經(jīng)過RT-PCR及測序鑒定，確定其為煙草中NAC轉(zhuǎn)錄子基因。
　　 4、預測