補腎活血方對膝關節(jié)假體周圍骨吸收及RANKL-RANK-OPG通路的干預研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來，隨著我國人口壽命的大幅提高，我國社會亦逐步步入老齡化社會，在此背景下，老年性疾病發(fā)病率逐步升高，體現(xiàn)在骨科方面即是退行性疾病及骨質疏松性疾病的發(fā)病率逐年升高，而膝OA（骨關節(jié)炎）則是目前退行性骨關節(jié)炎里面的最常見疾病，而隨著我國醫(yī)療技術水平的日益提高及社會健康觀念的日益提升，老年人追求良好生活質量的愿望較以前更加強烈，因此，愿意接受人工膝關節(jié)表面置換術人治療膝OA的人數(shù)大幅增加，因此人工膝關節(jié)表面置換術已成

2、為目前臨床常見、重要及廣泛的治療手段，尤其是終末期膝OA的常用手段之一，而伴隨著此術式的大量應用，膝關節(jié)假體的周圍骨溶解導致松動的病例數(shù)量大幅增加，二次手術不但增加了患者的經濟負擔及痛苦，同時亦帶來了巨大的醫(yī)療風險。目前膝關節(jié)假體周圍骨溶解的可能性較多，存在低毒性感染、應力機制及微粒機制等多種可能，而對應后兩種機制，目前西醫(yī)藥防治骨溶解主要以抗骨質疏松治療，調節(jié)骨代謝為主，依據(jù)骨質疏松研究中骨代謝機制使用調節(jié)骨代謝藥物并取得一定的效果，

3、近二十年，中醫(yī)中藥的抗骨質疏松研究無論在基礎研究和臨床研究上均做了大量工作，并取得了部分成果，但目前在中醫(yī)藥防治人工假體骨溶解方面尚存在大量空白，相關研究較欠缺，把中醫(yī)中藥在抗骨質疏松方面所研究的成果運用在膝關節(jié)置換術后的骨量丟失方面目前還是空白，故本人嘗試通過研究補腎強筋膠囊干預人工膝關節(jié)表面假體周圍骨吸收，并通過假體周圍骨密度、OPG、RANKL的變化及實驗室動物研究等證明其是否具有作用并初步闡明其相關機制。
　　研究方法:<

4、br>　　臨床部分以膝骨關節(jié)炎并行膝關節(jié)表面置換術患者在研究對象，實驗部分采用小鼠通過植入PMMA微粒進行造顱骨板骨吸收模型，通過檢測補腎活血方治療后各組血清OPG、RANKL蛋白濃度及顱骨OPG、RANKLmRNA表達，來揭示不同劑量的補腎活血方與OPG、RANKL變化的關系，并嘗試解釋補腎活血方與OPG、RANKL的關系，是否具有相關性，具體相關性如何。
　　一、臨床觀察研究
　　選取我院2013年2月-2014年2月廣

5、東省第二中醫(yī)院骨科病房的膝骨關節(jié)炎并行膝關節(jié)表面置換術后患者，證型符合者納入;西醫(yī)的診斷嚴格按照標準執(zhí)行，所有受試對象均需簽署知情同意書。試驗組27例，對照組25例，采用隨機雙盲對照研究，兩組均行單膝人工關節(jié)表面置換術，均采用LINK公司PS型假體行膝關節(jié)置換手術治療，所有假體均用骨水泥固定，所有患者術后均采用相同的康復方法，并于術后分期進行HSS評分。對照組行人工膝關節(jié)置換術，術后口服鈣爾奇D0.6g/次，2次/日，連續(xù)服用26周;試

6、驗組除執(zhí)行手術治療外，尚口服我院院內制劑補腎強筋膠囊，1粒/次，3次/天，連續(xù)服用26周，股骨假體周圍分為4個興趣區(qū)，分別為ROI14，脛骨假體周圍分為3個興趣區(qū)，分別為RoI1-3，應用雙能X線骨密度儀對各個區(qū)內的骨密度變化進行觀察，兩組患者術后1周、3月、6月、12月的HSS評分，應用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。
　　二、臨床試驗研究
　　入組患者于清晨空腹抽取靜脈血，離心處理后OPG、RANKL的測定均采用ELISA

7、法測定，分別測定術前、術后2周、3月、6月數(shù)值并記錄分析。膝關節(jié)置換手術治療，采用德國LINK公司PS型假體，所有假體均用骨水泥固定，所有患者術后均采用大致相同的康復方法，并于12個月隨訪時進行HSS評分。股骨假體周圍分為4個興趣區(qū)，分別為ROI1-4，脛骨假體周圍分為3個興趣區(qū)，分別為RoI1-3，應用雙能X線骨密度儀對各個區(qū)內的骨密度變化進行觀察，應用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。
　　三、實驗研究
　　選取實驗雄性小鼠

8、造模，采用小鼠40只，分為五組，第1組為空白組（假手術組），第2組為造模組模型組，第3組為補腎強筋膠囊低劑量組，第4組為補腎強筋膠囊中劑量組，第5組為補腎強筋膠囊高劑量組，第1組采取假手術處理，2、3、4、5組均自顱項切開后將PMMA顆粒溶液均勻涂抹于顱骨板上，分別予低、中、高劑量灌胃，正常飲食，處死后取顱骨組織，觀察并計算顱骨陷窩面積，提取顱骨中央骨組織總DNA采用PCR法行mRNA表達檢測分析，并行Western blotting法

9、檢測骨組織OPG、RANKL蛋白表達。
　　研究結果:
　　一、臨床觀察研究
　?。ㄒ唬〩SS評分:
　　結果顯示:所有患者經過12個月隨訪，隨訪期間患者均無感染、假體松動的情況發(fā)生，4例患者有輕微的膝部疼痛，但不影響活動。HSS評分:術后1周試驗組平均分48.44分，對照組48.41分，兩組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，術后3月試驗組平均得分67.96分，對照組63.72分，兩組有顯著差異(P＜0.01);術后

10、6月試驗組平均得分80.78分，對照組76.08分，兩組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);術后12月試驗組平均得分84.00分，對照組82.64分，兩組無統(tǒng)計學差異;兩組術前與術后1周評分比較，均有顯著性差異(P＜0.01);兩組術后6月及12月分別前后比較，試驗組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，對照組有顯著性差異(P＜0.01)。
　?。ǘ┕敲芏扔^察研究
　　1.ROI1區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1周比較，術

11、后1年平均骨密度減少20.32％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少11.05％(P＜0.01);與術后3月比較，術后6月平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與術后6月比較，術后1年平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少26.26％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少11.01％(P＜0.05);與術后3月比較，術后6月平均骨

12、密度下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，較術后1周下降23.73％(P＜0.01);與術后6月比較，術后1年平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.ROI2區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少19.30％(P＜0.01);與術后1周比較，術后

13、3月平均骨密度減少10.31％((P＜0.01));與術后3月比較，術后6月平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與術后6月比較，術后1年平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少25.18％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少9.96％(P＜0.01);與術后3月比較，術后6月平均骨密度下降，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，較術后1周下降18.33％

14、(P＜0.01);與術后6月比較，術后1年平均骨密度下降無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.ROI3區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少12.28％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少9.43％(P＜0.01)，術后6月平均骨密度減少

15、11.33％(P＜0.01)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少12.30％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少9.41％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少10.33％(P＜0.01)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　4.ROI4區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1

16、周比較，術后1年平均骨密度減少12.85％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少5.41％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少9.56％(P＜0.01)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少14.43％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少5.52％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少9.46％(P＜0.05)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P

17、＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)
　　5.ROI5區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少21.08％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少11.32％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少17.51％(P＜0.05)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少23.68％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨

18、密度減少10.92％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少17.69％(P＜0.01)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).
　　6.ROI6區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少14.57％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少8.29％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減

19、少13.53％(P＜0.01)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少13.17％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少7.92％(P＜0.01)，術后6月平均骨密度減少11.63％(P＜0.01)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).
　　7.ROI7區(qū)兩組平均骨密度
　　試驗組:與術后

20、1周比較，術后1年平均骨密度減少11.25％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少5.90％(P＜0.05)，術后6月平均骨密度減少9.39％(P＜0.01)。
　　對照組:與術后1周比較，術后1年平均骨密度減少11.24％(P＜0.01);與術后1周比較，術后3月平均骨密度減少5.85％(P＜0.01)，術后6月平均骨密度減少9.37％(P＜0.01)。
　　兩組術后1周平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(

21、P＞0.05);兩組術后1年平均骨密度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　8.術后3月、6月、12月股骨、脛骨密度變化
　　術后3月:試驗組股骨遠端假體周圍骨密度下降率分別為11.05％、10.31％、9.43％、5.41％，平均下降9.05％，對照組股骨遠端假體分別為11.01％、9.96％、9.41％、5.52％，平均下降8.98％;試驗組脛骨假體周圍骨密度下降率分別為11.32％、8.29％、5.90％，平均

22、下降8.50％，對照組脛骨假體周圍骨密度下降率分別為10.92％、7.92％、5.85％，平均下降8.23％。
　　術后6月:試驗組股骨遠端假體周圍骨密度下降率分別為18.64％、13.66％、11.33％、9.56％，平均下降12.85％，對照組分別為23.74％、18.33％、10.33％、9.46％，平均下降15.47％;試驗組脛骨假體周圍骨密度下降率分別為17.51％、13.53％、9.39％，平均下降13.48，對照組為

23、17.69％、11.63％、9.37％，平均下降12.90％。
　　術后12月:試驗組股骨遠端假體周圍骨密度下降率分別為20.32％、19.30％、12.28％、12.85％，平均下降16.19％，對照組股骨遠端假體分別為26.26％、25.18％、12.30％、14.43％，平均下降19.54％;試驗組脛骨假體周圍骨密度下降率分別為21.08％、14.57％、11.25％，平均下降15.63％，對照組脛骨假體周圍骨密度下降率分別

24、為23.68％、13.17％、11.24％，平均下降16.03％。
　　二、臨床試驗研究:
　　（一）OPG結果顯示:
　　兩組術前及術后3月比較，兩組數(shù)值相當(P＞0.05)，兩組同組間術前及術后3月比較，兩組數(shù)值均高于術前(P＜0.01);術后6月兩組比較，試驗組數(shù)值高于術前(P＜0.05)，試驗組術后6月與術后3月數(shù)值比較，低于術后3月(P＜0.05);對照組術后6月與術后3月比較，兩組數(shù)值相當(P＞0.05)。

25、
　?。ǘ㏑ANKL結果顯示:
　　RANKL兩組術前及術后3月比較，兩組數(shù)值相當(P＞0.05)，兩組同組間術前與術后3月數(shù)值比較，術后3月均大于術前(P＜0.05);術后3月兩組數(shù)值相當(P＞0.05);術后6月兩組間數(shù)值比較，對照組高于試驗組(P＜0.05)。
　?。ㄈ㎡PG/RANKL比值結果顯示:
　　兩組術前比較，比值相當(P＞0.05);兩組術后3月比較，比值相當(P＞0.05);兩組術后6月比

26、值比較，試驗組高于對照組(P＜0.05)。
　　三、動物實驗研究
　　顱骨陷窩觀察和面積計算:空白組（假手術組）小鼠鹵蓋骨骨質結構正常，未見明顯骨溶解及骨破壞，模型組與低劑量組、中劑量組面積相當(P＞0.05)，高劑量組面積最小(p＜0.01)。
　　PCR顯示:OPG:與空白組比較，各組mRNA的表達水平均不同程度降低(P＜0.05);模型組與低劑量組mRNA的表達水平相當(P＞0.05);高劑量組OPGmRNA的表

27、達水平與中劑量組相當(P＞0.05);高劑量組與低劑量濃度組比較，OPG mRNA的表達水平升高(P＜0.05)。RANKL:與空白組比較，各組mRNA表達水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型組mRNA與低劑量組、中劑量組mRNA表達水平相當(P＞0.05);高劑量組mRNA表達水平低于中劑量組(P＜0.05)。
　　Western-blot結果顯示:OPG結果顯示:與空白組比較，各組蛋白表達水平均不同程度降低(P＜0.05)

28、;高濃度組與中濃度組比較，蛋白表達水平相當(P＞0.05);與低劑量組比較，中劑量組表達水平升高(P＜0.05)。RANKL結果顯示:與空白組比較，各組蛋白表達水平均不同程度升高(P＜0.05)，模型組與低劑量組、中劑量組蛋白表達水平相當(P＞0.05);高劑量組蛋白表達水平低于中劑量組(P＜0.05)。
　　研究結論:
　　1.補腎活血方在臨床療效研究中可明顯改善試驗組ROI1區(qū)、ROI2區(qū)的骨密度下降及骨量丟失，證明補腎

29、活血方雖然不能阻止膝關節(jié)置換術后周圍骨量的丟失，但能夠一定程度上減少骨丟失量，有利于改善膝關節(jié)術后假體周圍骨吸收程度。
　　2.補腎活血方可以改善人工膝關節(jié)置換術后功能及癥狀;
　　3.補腎活血方可有效改善肝腎不足，筋脈瘀滯癥候;
　　4.補腎活血方可以提高血清OPG濃度及升高OPG/RANKL值;
　　5.高劑量的補腎活血方可顯著提高骨溶解模型小鼠的顱骨OPG蛋白表達及mRNA表達水平，抑制RANKL蛋白表達及