神經(jīng)鞘磷脂合成酶2基因敲除有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用.pdf

1、近來(lái)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊中有神經(jīng)鞘磷脂(SM)的聚集，血漿SM水平是致AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，載脂蛋白E基因敲除(ApoEKO)小鼠血清中的SM水平是野生型老鼠的4倍；抑制ApoEKO小鼠的SM合成可以明顯抑制AS的發(fā)生；Brand等利用新型的鼠單克隆抗體α-P65mAb首次證實(shí)了AS病變組織中有活化形式的核因子κB(NFκB)的存在，其水平明顯高于正常組織，并且認(rèn)為AS可能是NFκB介導(dǎo)的慢性炎癥病例的一個(gè)典型范例。Lube

2、rtoetal研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)鞘磷脂合成酶(SMS)的藥理學(xué)抑制劑(D609)阻斷了腫瘤壞死因子(TNFα)或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NFκB的活化。這些研究顯示，SM在AS的發(fā)生中起著非常重要的作用，抑制SM的合成可能會(huì)影響到NFκB的活化，進(jìn)而影響到AS的發(fā)生。
　　 為了研究SM和AS的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)紐約州立大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心引進(jìn)的SMS2基因敲除雜合子[SMS2(+/-)]小鼠3只(雄性一只，雌性?xún)芍?為種鼠，利用PCR方法鑒定培

3、育出的SMS2(-/-)小鼠為模型，探討SM引起AS發(fā)生的原理和機(jī)制，從而為臨床治療和和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 目的：研究AS的發(fā)生與SM代謝之間的關(guān)系，探討SM引起AS的發(fā)生機(jī)制和原理，從而為AS的臨床治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 方法：利用從美國(guó)紐約州立大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心引進(jìn)的3只SMS2(+/-)小鼠(雄性一只，雌性?xún)芍唬尘盀镃57BL/6J小鼠)為種鼠，采用雜交、回交、互交的方法進(jìn)行繁殖，用酚氯仿提取法提取小

4、鼠基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小鼠基因型做出鑒定，獲得雄性和雌性SMS2純合子(-/-)小鼠，按照同樣方法進(jìn)行繁殖；以SMS2(-/-)小鼠為研究對(duì)象，野生型(WT)小鼠為對(duì)照組，從3月齡起開(kāi)始喂養(yǎng)高脂飲食，每天每只7g，喂養(yǎng)3個(gè)月，每隔一個(gè)星期測(cè)量體重；解剖SMS2(-/-)小鼠和野生型小鼠主動(dòng)脈弓和胸腹主動(dòng)脈，觀察AS斑塊情況，進(jìn)行比較，利用血脂檢測(cè)試劑盒和酶學(xué)方法檢測(cè)血脂水平和血清SM含量；內(nèi)毒素誘導(dǎo)小鼠腹腔

5、巨噬細(xì)胞的形成，用RPMI-1640培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)；利用WesternBlotting的方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)NFκB的水平；采用成組t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)高脂高膽固醇飲食后，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈弓和胸腹主動(dòng)脈產(chǎn)生了大量的AS斑塊；而SMS2(-/-)小鼠AS斑塊面積明顯減??；SMS2(-/-)小鼠與WT小鼠相比，體重明顯減輕，變化有顯著差異(p＜0.05)；經(jīng)檢測(cè)，正常飲食情況下，實(shí)驗(yàn)組小鼠與

6、對(duì)照組小鼠相比，SM水平明顯降低，變化有顯著差異(p＜0.05)，而甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平變化均無(wú)差異(p＞0.05)；高脂高膽固醇飲食后，實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，SM水平明顯降低，變化有顯著差異(p＜0.05)，而甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平變化均無(wú)差異(p＞0.05)；經(jīng)WesternBloting檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)NFκB活性明顯降低，而對(duì)照組小

7、鼠NFκB活性很高。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功繁育出基因敲除動(dòng)物模型：培育的SMS2(-/-)小鼠可作為研究AS的理想的動(dòng)物模型。
　　 2、SMS2基因缺失使血清SM水平明顯下降，由于SMS是SM合成中的最后一個(gè)酶，那么SMS2可能是血清SM含量的決定因素之一。
　　 3、SMS2(-/-)小鼠與WT小鼠相比，主動(dòng)脈弓和胸腹主動(dòng)脈AS斑塊面積明顯減小，這說(shuō)明SMS2可能是AS治療新的靶點(diǎn)。