酸性鞘磷脂酶與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系研究.pdf

1、研究背景:急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是發(fā)病率和死亡率極高的心血管疾病，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。其是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征。易損斑塊破裂是ACS發(fā)生最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)，近年來(lái)大量研究證實(shí)各種因素所致的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解是導(dǎo)致易損斑塊破裂的主要原因之

2、一。
　　 新近大量研究發(fā)現(xiàn)酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASMase)與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ASMase通過(guò)水解鞘磷脂(Sphingomyelin)生成神經(jīng)酰胺（Ceramide），誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，增加低密度脂蛋白的相互聚集，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成等病理變化，參與了AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道其是否通過(guò)影響斑塊的穩(wěn)定性，從而在ACS的

3、發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。MMPs的激活與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，而最新研究發(fā)現(xiàn)ASMase可能介導(dǎo)了炎癥因子刺激的MMPs過(guò)表達(dá)過(guò)程，因此本研究首先在臨床ACS患者中探討ASMase與其發(fā)病的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，再?gòu)募?xì)胞水平進(jìn)一步研究ASMase是否通過(guò)介導(dǎo)MMPs的過(guò)表達(dá)從而影響斑塊的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致ACS的發(fā)生。
　　 第一部分血漿ASMase活性，Ceramide水平與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性研究
　　 目的:探討AS

4、Mase活性，Ceramide水平與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性之間是否相關(guān)。
　　 方法:共納入212名冠心病（coronary artery disease，CAD）患者及52名健康體檢者，所有研究對(duì)象分為三組，急性冠脈綜合征組(ACS)114名，穩(wěn)定型心絞痛組(SAP)98名和正常對(duì)照組(Contro1)52名。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血漿中Sphingomyelin水平;采用高效液相色譜法（high-performance liqu

5、id chromatographic assay, HPLC）檢測(cè)血漿中ASMase活性;采用質(zhì)譜-液相色譜聯(lián)用分析法(LS-MS)檢測(cè)血漿Ceramide水平;采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)血漿中MMP-9，腫瘤壞死因子alpha（tumor necorsis factor alpha，TNF-α）水平。比較不同類(lèi)型冠心病及正常對(duì)照組血漿中ASMase活性，Sphingomyelin，Ceramide，MMP-9，TNF-α水平變

6、化，并進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1) ACS組與SAP組患者血漿Sphingomyelin水平高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，但ACS組血漿Sphingomyelin水平與SAP組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 (2) ACS組與SAP組患者血漿ASMase活性、Ceramide水平高于正常對(duì)照組（P＜0.05），且ACS組高于SAP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　

7、 (3) ACS組患者M(jìn)MP-9水平高于SAP組與正常對(duì)照組(P＜0.05)，而SAP組血漿MMP-9水平與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 (4) ACS組與SAP組患者血漿TNF-α水平高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，且ACS組高于SAP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 (5) ACS患者血漿ASMase活性與血漿Ceramide水平相關(guān)，且二者均與MMP-9，TNF-α水平相關(guān)，與S

8、phingomyelin水平無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 血漿ASMase活性，Ceramide，MMP-9及TNF-α水平與冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)，測(cè)定血漿ASMase活性有助于確定具有不穩(wěn)定斑塊的ACS高危人群。
　　 第二部分ASMase介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)
　　 目的:探討ASMase是否介導(dǎo)了TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)。
　　 方法:
　　

9、(1)研究TNF-α處理對(duì)巨噬細(xì)胞酸性鞘磷脂酶(acidsphingomyelinase，ASMase)，MMP-9表達(dá)及Ceramide水平的影響。實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組和不同濃度的TNF-α組（用含10ng/ml，30ng/ml，100ng/mlTNF-α的培養(yǎng)液孵育巨噬細(xì)胞24h）。采用Real-Time PCR及Western-blot法分別從基因及蛋白水平檢測(cè)ASMase，MMP-9表達(dá)，用LS-MS法檢測(cè)Ceramide水平。

10、r>　　 (2)研究ASMase抑制劑desipramine預(yù)處理對(duì)TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)及Ceramide水平的影響。實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組:用含1％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液孵育巨噬細(xì)胞24h; TNF-α組:用含100ng/ml TNF-α的培養(yǎng)液孵育巨噬細(xì)胞24h;+desipramine組:用5μMdesipramine（ASMase抑制劑）孵育細(xì)胞120min后，加入終濃度為100ng/ml的TNF-α培養(yǎng)液

11、孵育巨噬細(xì)胞24h，采用Real-Time PCR及Western-blot法分別從基因及蛋白水平檢測(cè)MMP-9表達(dá)，用LS-MS法檢測(cè)Ceramide水平。
　　 結(jié)果:
　　 (1)TNF-α（10ng/ml，30ng/ml，100ng/ml）呈濃度依賴(lài)性地增加ASMase，Ceramide的水平及MMP-9的表達(dá)。
　　 (2)與對(duì)照組相比，TNF-α(100ng/ml)處理巨噬細(xì)胞24 h顯著升高細(xì)胞Ce