小麥表皮蠟質(zhì)二酮合成候選基因的篩選及功能鑒定.pdf

1、植物表皮蠟質(zhì)位于植物的最外層，是隔絕植物與外界環(huán)境發(fā)生交換的屏障。表皮主要由超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物組成，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中尤為重要，不僅可以有效地阻止植物的非氣孔性水分散失、防止植物受到紫外損傷，還具有維持清潔、防止病蟲(chóng)害侵蝕等作用。中鏈烷烴羥基化酶(Midchain Alkane Hydroxylase，MAH1)是參與植物蠟質(zhì)合成脫碳途徑中的重要酶，主要負(fù)責(zé)催化脫碳途徑中次級(jí)醇和酮的合成。小麥作為重要的糧食作物，其表皮蠟質(zhì)主要由

2、烷烴，初級(jí)醇、脂肪酸和脂肪醛組成，除此之外，還積累了豐富的二酮。本研究主要利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、氣相色譜離子化火焰檢測(cè)器(GC-FID)對(duì)17個(gè)小麥品種穗部蠟質(zhì)成分及含量進(jìn)行分析以了解小麥蠟質(zhì)的成分及組成特點(diǎn)，并以擬南芥AtMAH1序列為參考，在小麥數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索篩選同源性較高的序列，以小麥310為模板，克隆了8個(gè)小麥二酮合成基因TaMAH，并將基因轉(zhuǎn)入番茄“Micro Tom”中，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片蠟質(zhì)的成分及含量進(jìn)行

3、分析以驗(yàn)證TaMAH功能，結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)對(duì)于17個(gè)小麥品種（系）材料穗部蠟質(zhì)成分及含量的分析，發(fā)現(xiàn)不同蠟質(zhì)表型的小麥品種（系）穗部蠟質(zhì)成分相同，但蠟質(zhì)總量及各組分含量存在差異，白霜狀小麥穗部蠟質(zhì)總含量高于嫩綠小麥（中國(guó)春），其中白霜狀小麥穗部蠟質(zhì)中β-二酮為主要成分，約占分離出總物質(zhì)的70.68％-88.29％，中國(guó)春穗部則以二酮和烷烴為主要成分，分別占38.36％和38.14％。β-二酮的衍生產(chǎn)物羥基-β-二酮僅存在于

4、白霜狀小麥品種蠟質(zhì)中，在中國(guó)春穗部蠟質(zhì)中并未被檢測(cè)到。
　　2.利用同源比對(duì)從小麥數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了同源性較高的45個(gè)基因，通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，從45個(gè)小麥二酮合成候選基因中選取了10個(gè)較為可靠的基因，命名為T(mén)aMAH1-TaMAH10，基因序列長(zhǎng)度約為1300bp-1500bp。通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，TaMAH2與TaMAH5所編碼的蛋白一致，TaMAH1、TaMAH2、TaMAH3、TaMAH4、TaMAH5和TaMAH9與At

5、MAH1親緣關(guān)系較近，而TaMAH6、TaMAH7、TaMAH8和TaMAH9則與AtMAH1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，最終成功克隆基因8個(gè)基因并完成植物表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將8個(gè)小麥TaMAH基因?qū)敕选癕icro Tom”中，利用PCR篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，最終獲得54棵轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。對(duì)陽(yáng)性植株葉片蠟質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系葉片蠟質(zhì)成分并未發(fā)生改變，TaMAH1B、TaMAH3陽(yáng)性株系蠟質(zhì)總含量明