生防菌菌株A抗真菌譜、抗菌蛋白的分離純化及抗菌機(jī)理研究.pdf

1、化學(xué)殺菌劑暴露出的諸多難以克服的缺點(diǎn)使新型生防菌劑研發(fā)成為一種趨勢。在眾多的生防細(xì)菌中，枯草芽孢桿菌憑借易培養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，對人畜無毒等優(yōu)點(diǎn)為眾多科研人員所青睞。目前國內(nèi)外已有商品化的枯草芽孢桿菌制劑，但用的枯草芽孢桿菌菌株不盡相同，因此防治對象也各不相同。本研究以本實(shí)驗(yàn)室從玉米小斑病葉片上分離得到的一株生防細(xì)菌菌株A(經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，菌種保藏編號為CGMCCNo.1982，對玉米小斑病具較高的拮抗活性)為實(shí)驗(yàn)材料，對菌株A的

2、拮抗譜及拮抗性能穩(wěn)定性做了進(jìn)一步研究；同時(shí)，對菌株A分泌的抗真菌蛋白進(jìn)行了分離、純化和鑒定；研究了抗菌蛋白的抗真菌機(jī)理。具體如下： 1.測定了菌株A的抑菌譜及其拮抗性能穩(wěn)定性。以20種致病真菌和8種食用菌為材料，采用對峙培養(yǎng)法測定了菌株A的抑菌譜，結(jié)果表明：菌株A表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性。在20種致病真菌中，菌株A對柿角斑尾孢霉、蘋果黑星病菌和番茄果腐瘤座菌等11種致病真菌的拮抗能力最強(qiáng)；在8種食用菌中，菌株A對蛹蟲草，黃傘和黑木耳

3、的拮抗能力最強(qiáng)。 以玉米小斑病菌為指示菌，檢測了菌株A拮抗活性對溫度、pH及傳代的穩(wěn)定性。將搖瓶培養(yǎng)后的菌液分別于-20℃，-4℃，20℃，37℃，50℃下靜置7d，菌株A拮抗能力沒有明顯變化；在pH1～11條件下培養(yǎng)的菌株A拮抗能力無明顯影響；連續(xù)繼代培養(yǎng)10代，菌株A拮抗能力為出發(fā)菌株的95.8％。菌株A的拮抗活性表現(xiàn)出對溫度、pH及傳代的穩(wěn)定性。 2.去除菌體后的菌株A發(fā)酵液經(jīng)30％～60％飽和度的硫酸銨沉淀得到粗

4、蛋白，采用DE-52陰離子交換柱和NaCl梯度沈脫方法對粗蛋白進(jìn)行分離、純化，得到活性組分V，命名為FV。SDS-PAGE檢測為單帶，然后對其進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測得出最匹配結(jié)果為RNA-binding protein Hfq[Bacillus pumilus SAFR-032]。該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為8478.5，等電點(diǎn)為8.09。 3.以玉米小斑病菌為材料，研究了抗菌蛋白FV對致病真菌的作用機(jī)理。 (1)

5、FV對玉米小斑病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響。結(jié)果顯示：抑制玉米小斑病菌孢子萌發(fā)半數(shù)有效濃度(EC50)為138.32μg/mL。抑制附著胞形成的半數(shù)有效濃度(EC50)為22.23μg/mL。經(jīng)過濃度為17.29μg/mL的抗菌蛋白FV處理的玉米小斑病菌附著胞畸形，膨大成圓泡狀。 (2) FV對玉米小斑病菌菌絲形態(tài)的影響。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FV處理后的玉米小斑病菌菌絲出現(xiàn)明顯畸形，在菌絲頂端、中部出現(xiàn)膨大泡囊；隨著處理時(shí)

6、間的延長，菌絲畸形現(xiàn)象更加明顯。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V處理后的菌絲表面變粗糙；膨大泡囊表面凹凸不平，并殘留有碎片。 (3) FV對玉米小斑病菌菌絲細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V處理后，菌絲細(xì)胞致密、有序、細(xì)胞器清晰可見的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)受到影響。原生質(zhì)變得"稀薄"，同時(shí)出現(xiàn)"空泡"；細(xì)胞器發(fā)生不同程度的分解；細(xì)胞壁不規(guī)則加厚，并可見細(xì)胞壁分解現(xiàn)象；有的菌絲里出現(xiàn)"子菌絲"。 (4)FV對玉米小斑病菌菌