人類(lèi)UHRF1基因腫瘤生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目的：研究hUHRF1基因表達(dá)水平改變對(duì)乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及放射治療敏感性的影響，及其生物學(xué)功能的作用機(jī)制，為研究乳癌的發(fā)生、發(fā)展和治療提供了新的研究方向和理論基礎(chǔ)，為將來(lái)hUHRF1基因在腫瘤臨床治療應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： ①采用Western Blot法，檢測(cè)多種人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中hUHRF1的蛋白表達(dá)情況；Northern Blot法對(duì)臨床乳癌組織樣本和正常乳腺組織中hUHRF1的R

2、NA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)； ②根據(jù)GeneBank中hUHRF1的基因序列，自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增hUHRF1基因全長(zhǎng)cDNA的引物一對(duì)，構(gòu)建hUHRF1的真核表達(dá)載體和腺病毒表達(dá)載體； ③采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofactamin2000介導(dǎo)的方法，進(jìn)行hUHRF1基因轉(zhuǎn)染，在含G418的培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆，采用RT—PCR和Western Blot法檢測(cè)陽(yáng)性克隆中hUHRF1的RNA和蛋白表達(dá)水平； ④采用MTT法觀察hU

3、HRF1基因轉(zhuǎn)染，對(duì)體外培養(yǎng)的不同p53基因表型、不同組織來(lái)源的乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響；皮下瘤液接種法，制備乳癌動(dòng)物模型，觀察hUHRF1基因在體內(nèi)對(duì)乳癌生長(zhǎng)的影響； ⑤細(xì)胞接受不同劑量的X射線、UV輻照和γ射線照射后的克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞輻射敏感性的變化； ⑥劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室法，觀察細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化； ⑦流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡變化；免疫組化法觀察動(dòng)物腫瘤組織中新生血管的形成；

4、染色體畸變分析觀察基因組穩(wěn)定性變化；Western Blot法檢測(cè)調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白、細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平變化。 結(jié)果： ①腫瘤細(xì)胞中hUHRF1的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞；臨床乳癌組織中hUHRF1的RNA水平較正常乳腺組織的表達(dá)水平高； ②構(gòu)建的hUHRF1真核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切后電泳和擴(kuò)增片斷測(cè)序，證實(shí)載體構(gòu)建成功； ③

5、G418篩選得到的陽(yáng)性克隆，經(jīng)RT—PCR和Western Blot證實(shí)，hUHRF1基因在乳癌細(xì)胞中高表達(dá)，表明高h(yuǎn)UHRF1表達(dá)的細(xì)胞株篩選成功； ④MTT的結(jié)果表明：hUHRF1可以促進(jìn)p53突變型乳癌細(xì)胞MDA—MB—231和BT—549的生長(zhǎng)，而對(duì)p53野生型乳癌細(xì)胞MCF—7的生長(zhǎng)未見(jiàn)明顯影響；而且，hUHRF1的高水平表達(dá)，可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管形成，在體內(nèi)促進(jìn)乳癌細(xì)胞的生長(zhǎng)； ⑤流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明：hU

6、HRF1基因轉(zhuǎn)染后，p53突變型乳癌細(xì)胞MDA—MB—231的細(xì)胞周期進(jìn)程中，G0/G1比例由69．157%降至49．854%，subG1%由16．31%降至9．32%，差異有統(tǒng)計(jì)意義；而p53野生型乳癌細(xì)胞MCF—7的細(xì)胞周期進(jìn)程的G0/G1比例由73．874%降至72．812%，subG1%由14．88%降至8．08%，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義，即外源性hUHRF1的高表達(dá)，可明顯縮短p53突變型乳癌細(xì)胞MDA—MB—231的細(xì)胞周期G0/

7、G1期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而對(duì)p53野生型乳癌細(xì)胞MCF—7的生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯影響。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期G1期調(diào)控因子cyclinD1和凋亡相關(guān)因子Bax在MDA—MB—231細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，hUHRF1基因轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)cyclinD1的表達(dá)水平增強(qiáng)，而抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，與我們流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果一致； ⑥集落形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，hUHRF1高水平表達(dá)可以降低乳癌細(xì)胞MDA—MB—231對(duì)X

8、射線、UV輻照，HeLa細(xì)胞對(duì)γ射線的輻射敏感性；采用siRNA，“敲除”hUHRF1基因，可增加乳癌細(xì)胞MDA—MB—231的輻射敏感性； ⑦h(yuǎn)UHRF1的高水平表達(dá)，可以誘導(dǎo)輻射后的細(xì)胞發(fā)生明顯的G2期阻滯；抑制細(xì)胞凋亡；抑制輻照后盼細(xì)胞中cyclinB1和Bax的表達(dá)，而B(niǎo)cl—2的表達(dá)水平影響不明顯。 ⑧Western Blot法檢測(cè)DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的調(diào)節(jié)因素XRCC4，Ku70，Ku80蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)

9、果顯示：在相同劑量的X射線照射下，hUHRF1基因的高表達(dá)，可以誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞MDA—MB—231中Ku70，Ku80的表達(dá)增強(qiáng)；染色體的畸變率降低；但在腺病毒感染的HeLa細(xì)胞中，Ad5—hUHRF1僅使XRCC4的表達(dá)水平增加，采用siRNA“敲除”HeLa細(xì)胞中XRCC4的表達(dá)，改變了hUHRF1調(diào)節(jié)的輻射敏感性。 ⑨劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室法的結(jié)果顯示：hUHRF1高水平表達(dá)，可以增強(qiáng)乳癌細(xì)胞MDA—MB—231的侵襲和

10、轉(zhuǎn)移能力；但是，Western Blot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hUHRF1基因高水平表達(dá)并不改變PTEN和maspin的表達(dá)水平，但是降低細(xì)胞的PTEN和maspin表達(dá)水平則影響了hUHRF1對(duì)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。 結(jié)論： ①hUHRF1基因高表達(dá)，在體外通過(guò)縮短細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)p53突變型乳癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)p53野生型乳癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 ②提高h(yuǎn)UHRF1基因表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管形成，