miRNA與肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)性和高原自噬對(duì)心肌缺血再灌注的影響.pdf

1、第一部分:microRNA在左向右分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá)
　　肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指靜息狀態(tài)下用右心導(dǎo)管(RHC)測(cè)得的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)至少高于25mmHg的一種復(fù)雜病理生理綜合征。肺動(dòng)脈高壓既可以是原發(fā)性的，也可以是繼發(fā)于其它一些疾病。肺動(dòng)脈高壓包括肺內(nèi)或與肺相關(guān)血管的收縮緊縮，這使得心臟很難向肺供血。長(zhǎng)久以往，受影響的血管就會(huì)形成纖維化，進(jìn)而

2、繼續(xù)升高肺內(nèi)的血管壓力和影響血流量。此外，心臟增加的工作負(fù)荷會(huì)使得右心室肥厚，以至于心臟無(wú)法將血泵入肺內(nèi)，最終引起右心力衰竭。血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞都參與到了PAH的發(fā)展過(guò)程。左向右分流性肺動(dòng)脈高壓是一種最常見的肺動(dòng)脈高壓。左向右的分流會(huì)引起肺血管流量和壓力的持續(xù)增高，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增生，使得肺血管重構(gòu)，最終形成肺動(dòng)脈高壓。
　　microRNA(miRNA)是一類僅由18-25個(gè)核苷酸

3、構(gòu)成的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。其通過(guò)對(duì)特定靶基因mRNA的翻譯過(guò)程起抑制或直接降解mRNA發(fā)揮作用。目前已知miRNA幾乎參與了各種病理生理過(guò)程，并發(fā)揮重要作用。但是它在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用卻鮮有報(bào)道。
　　本課題以左向右分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型為主要研究對(duì)象，初步研究miRNAs與肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，并預(yù)測(cè)與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的靶基因位點(diǎn)，為深入探討應(yīng)用miRNAs靶向治療肺動(dòng)脈高壓提供理論依據(jù)。<

4、br>　　方法
　　1.左向右分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的建立
　　(1)運(yùn)用頸動(dòng)靜脈分流術(shù)建立左向右分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。
　　(2)在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)分流組和對(duì)照組大鼠的平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)。
　　(3)取大鼠肺組織，行HE染色觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)變化。
　　2.應(yīng)用芯片檢測(cè)技術(shù)，分析肺動(dòng)脈高壓形成后miRNAs表達(dá)譜的變化
　　(1)應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)，檢測(cè)差異性表達(dá)

5、的miRNAs。
　　(2)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證明顯差異性表達(dá)的miRNAs。
　　3.應(yīng)用靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)差異性表達(dá)的miRNAs所調(diào)控的與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的靶基因。
　　結(jié)果
　　1.成功構(gòu)建大鼠左向右分流性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，且與對(duì)照組相比，分流組大鼠的肺動(dòng)脈收縮壓(PASP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)增高。HE染色顯示分流組肺小動(dòng)脈血管壁增厚，管腔狹窄。
　　2.芯片結(jié)果顯示，在肺動(dòng)脈高壓大鼠

6、中有89種miRNA上調(diào)，20種miRNA下調(diào)。上調(diào)的miRNA包括miR-130b、miR-98和miR-193等等。下調(diào)的miRNA包括miR-127、miR-379和miR-541等等。對(duì)其中差異性最明顯的miR-130b、miR-127和miR-98，用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　3.運(yùn)用靶基因預(yù)測(cè)軟件，得到miR-98和miR-130b的預(yù)測(cè)下游靶基因包括Yod1，Edn1, PPARG, HSP40, Esm1。

7、
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用套管法連接大鼠頸總動(dòng)脈和頸外靜脈，可形成持續(xù)的低流量體肺分流，誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)，進(jìn)而形成左向右分流性肺動(dòng)脈高壓。
　　2.在肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中存在明顯差異性表達(dá)的miRNAs，并且可以通過(guò)RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。miRNA在肺動(dòng)脈高壓的形成過(guò)程中可能起重要作用，而預(yù)測(cè)出的靶基因包括Yod1，Edn1，PPARG，HSP40，Esm1。
　　第二部分:高原患兒Bnip3與自噬水平對(duì)心肌缺

8、血再灌注損傷的影響研究
　　高原先天性心臟病的發(fā)病率大概為1.37％，是平原人群的2到3倍。2005年中國(guó)人口普查發(fā)現(xiàn)，藏族人群總數(shù)為5，416，021，大部分生活在海拔3000米以上。因此有很多患有先天性心臟病的藏族人需要接受心臟手術(shù)。由于醫(yī)療衛(wèi)生水平的改善和更便捷的交通，青藏高原越來(lái)越多的先天性心臟病患者得到了去平原心臟中心接受心臟手術(shù)的機(jī)會(huì)。然而，關(guān)于高原病人心臟手術(shù)期間心肌缺血再灌注損傷的報(bào)道卻很少。
　　青藏高原居

9、民的平均動(dòng)脈氧分壓大概為57mmHg。目前已肯定慢性缺氧能夠提高Bnip3的表達(dá)，而Bnip3能夠通過(guò)抑制雷帕霉素靶蛋白來(lái)提高自噬水平。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自體降解過(guò)程，也就是細(xì)胞內(nèi)的衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被降解和回收的過(guò)程。平時(shí)自噬保持基線水平，但在應(yīng)激條件下，例如養(yǎng)分耗竭或者缺氧，會(huì)進(jìn)一步被誘導(dǎo)升高。高水平自噬可以使得青藏高原居民適應(yīng)高海拔環(huán)境并耐受缺氧。
　　體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究表明自噬在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用，提高自噬能

10、力可以保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷。特別是自噬的基礎(chǔ)水平對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗功能紊亂的細(xì)胞器具有重要作用。然而，關(guān)于人類的這方面臨床報(bào)道甚少。
　　基于以上情況，我們推測(cè)西藏的先天性心臟病患者比平原患者能夠更好的抵抗心臟手術(shù)中的心肌缺血再灌注損傷，這是由于長(zhǎng)期的慢性缺氧導(dǎo)致他們具有更高的基礎(chǔ)自噬水平。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們研究了接受心臟手術(shù)的高原患兒和平原患兒基礎(chǔ)自噬水平以及其上游與缺氧相關(guān)的蛋白Bnip3的變化，以探討自噬

11、水平對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:
　　1.高原組和平原組患者的入選標(biāo)準(zhǔn)（入選標(biāo)準(zhǔn)包括患者年齡，性別，民族，疾病類型等）
　　2.高原組和平原組的心肌缺血再灌注損傷程度的比較
　　(1)檢測(cè)比較兩組心肌肌鈣蛋白的變化。
　　(2)檢測(cè)比較兩組腦鈉肽的變化。
　　(3)應(yīng)用HE染色技術(shù)，檢測(cè)兩組心肌病變情況。
　　(4)應(yīng)用TUNEL染色技術(shù)，檢測(cè)兩組心肌病變情況。
　　(5)應(yīng)用

12、透射電鏡技術(shù)，檢測(cè)兩組心肌病變情況。
　　3.利用Westem Blot來(lái)評(píng)價(jià)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ，Beclin1和LAMP2以及它們的上游蛋白Bnip3。
　　(1)利用Western Blot來(lái)評(píng)價(jià)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ，Beclin1和LAMP2水平的變化。
　　(2)利用Western Blot來(lái)評(píng)價(jià)上游蛋白Bnip3水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.12名長(zhǎng)期居住在青藏高原的藏族患者（海拔＞3000

13、m）與12名長(zhǎng)期居住在平原的患者（海拔＜500m）成功入選本研究。
　　2.高原組術(shù)后6小時(shí)的心肌肌鈣蛋白濃度，腦鈉肽增長(zhǎng)速度以及術(shù)后凋亡比明顯低于平原組。平原組心房組織的心肌病理改變比高原組嚴(yán)重。
　　3.無(wú)論是術(shù)前還是術(shù)后的LC3Ⅱ，LAMP2以及上游的Bnip3水平，高原組都明顯高于平原組(P＜0.05)。而缺血再灌注后Beclin1的水平在高原組和平原組無(wú)明顯差異性（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　高原