不同修飾模式的肝素寡糖的化學酶法合成及肝素酶的底物特異性研究.pdf

1、肝素和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)是由氨基葡萄糖(GlcN)和葡萄糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)以1→4糖苷鍵連接而成的二糖單元組成的糖胺聚糖，二糖單元的多個位置可以被硫酸化修飾，因此結構極其復雜。肝素/HS中豐富的寡糖序列是其表現出多種多樣的生物活性的結構基礎。針對天然肝素的動物源性和結構不均一性造成的安全隱患，合成結構確定的肝素/HS寡糖受到越來越多重視。單純化學法合成盡管進展迅速，但仍面臨合成步

2、驟多、產率低等挑戰(zhàn)。最近發(fā)展的化學酶法策略因具有立體選擇性強、產率高等優(yōu)點，有望發(fā)展成為一種理想的肝素和HS寡糖的合成新技術。因此，本課題擬利用化學酶法合成具有不同硫酸化模式的肝素寡糖。此外，細菌來源的肝素酶(heparinases或heparin lyases)能夠通過β-消除機制降解肝素及HS，是表征其結構和制備低分子量寡糖的重要工具酶。但是，之前的研究多以肝素及其衍生物為底物探究其催化機制和切割活性，結構不均一的多糖底物很可能對酶

3、解活性產生干擾，極大增大了產物分析的難度，更難以清晰闡明肝素酶作用于不同切割位點時的差異。因此，本課題根據肝素酶可能的切割位點設計、合成一系列結構均一確定的HS寡糖作為底物，并深入探究三種肝素酶的底物適應性，為拓展肝素酶的應用奠定基礎。
　　本學位論文取得的成果及結論包括以下幾個方面:
　　1.糖基供體和硫酸基供體的規(guī)?；苽?br>　　利用N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)或N-三氟乙酰氨基葡萄糖(GlcNTFA)、ATP

4、、UTP為原料，在三種重組酶NahK、GlmU、PPA的共同催化作用下合成尿菅二磷酸(UDP)-GlcNTFA/UDP-GlcNAc;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)為原料，由UDP-Glc脫氫酶、乳酸脫氫酶(LDH)催化合成UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)。經強離子交換柱層析純化后，糖基供體的純度可達98％以上，制備規(guī)模可達克級。以Na2SO4、 ATP為原料，利用ATP硫酸化酶、APS激酶催化合成硫酸基供體PAPS，純化后

5、的產物純度達99％，制備規(guī)模達到克級。
　　2.肝素六糖的合成、純化及結構表征
　　以對硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷(GlcA-PNP)為起始原料，利用糖基轉移酶KfiA或PmHS2的催化，在其非還原端交替添加GlcNTFA(GlcNAc)或GlcA得到HS六糖骨架，每步反應產率高達98％，經反相C18柱層析純化，得到純度高于90％的六糖骨架，合成規(guī)模達百毫克級。利用LiOH脫除三氟乙?；螅訮APS為硫酸基供體，由N-硫

6、酸基轉移酶(NST)催化合成N-硫酸化六糖。然后在C5異構化酶和2-O硫酸基轉移酶（2-OST）的共同催化下，使糖鏈中介于兩個N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的GlcA殘基轉變?yōu)?-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)。最后由6-O硫酸基轉移酶1/3(6-OST1/3)催化使寡糖的GlcNS或GlcNAc發(fā)生6-O-硫酸化修飾（GlcNS6S或GlcNAc6S）。三種硫酸化修飾模式的肝素寡糖產率分別為99％、72％、99％，經離子交換柱層析

7、純化后的寡糖純度均高達99％，合成規(guī)模達到百毫克級。ESI-MS及NMR分析表明不同修飾模式的肝素六糖產物的結構均正確。
　　3.肝素酶的底物特異性研究
　　根據肝素酶可能的切割位點設計、并利用化學酶法合成了一系列結構確定的肝素及HS寡糖，HPLC分析其純度＞90％，ESI-MS測定表明結構的正確性。以合成的寡糖為底物，利用HPLC分析測定肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在不同條件下對它們的切割作用，以探究酶對不同底物的催化特異性。同時利用

8、表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)技術初步研究了肝素酶Ⅲ與不同HS寡糖底物的相互作用。研究結果表明:(1)肝素酶Ⅰ不能切割GlcN與非硫酸化糖醛酸之間的糖苷鍵位點（GlcN-GlcA或GlcN-IdoA），僅能切割-GlcNS-IdoA2S-，-GlcNS6S3S-IdoA2S-、-GlcNS-GlcA2S-之間的糖苷鍵，這一結果表明2-O-硫酸化糖醛酸(UA2S)是肝素酶Ⅰ切割必需的，而Glc

9、N的6-O-或3-O-硫酸化修飾對切割作用影響不大。(2)肝素酶Ⅲ可以切割含主要切割位點（GlcNAc-GlcA或 GlcN S-GlcA)的三糖底物（Tri-NAc或Tri-NS），但對Tri-NAc的催化效率顯著高于Tri-NS。肝素酶Ⅲ能夠耐受含不同修飾的GlcN(GlcNH2、GlcNAc6S及GlcNS6S)與GlcA之間的次要切割糖苷鍵，但催化效率顯著低于對應的主要三糖底物，提示N-非取代或6-O-硫酸化修飾均會降低肝素酶Ⅲ

10、對HS寡糖底物的反應活性。肝素酶Ⅲ對含IdoA的次要切割位點(GlcNS-IdoA)的反應效率在反應初期低于主要位點GlcNS-GlcA，但總體差別不大。HS寡糖中的IdoA2S大大降低肝素酶Ⅲ對其還原端相鄰的GlcNS-GlcA位點的切割效率，但是對其非還原端的位點的影響不大。肝素酶Ⅲ對底物的特異性強弱與底物分子大小有關的，即其對分子量越大的底物切割效率越高。肝素酶Ⅲ對含有多個位點的HS寡糖中的切割次序為隨機切割，這與內切酶的特性相一

11、致;但是相比于還原端和非還原端，肝素酶Ⅲ對內部糖苷鍵具有更高的切割偏好性。SPR分析表明，單純通過酶與底物間親和力大小來判斷酶對底物切割效率并不完全可取，因為寡糖底物結構、帶電荷情況極其復雜，從而可能會導致寡糖底物與酶的錯誤結合而阻礙催化反應。(3)肝素酶Ⅱ能夠切割含肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ作用位點的寡糖;除對含-GlcNS6S-GlcA-位點的寡糖切割效率高于肝素酶Ⅲ，肝素酶Ⅱ對其他含肝素酶Ⅲ作用位點寡糖的反應活性低于肝素酶Ⅲ;肝素酶Ⅱ對肝