基因重組hVEGF165腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及其在間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、本實(shí)驗(yàn)利用AAV包裝平臺(tái)——rAAV-Helperfreesystem，構(gòu)建攜帶人VEGF165基因的重組AAV和攜帶EGFP報(bào)告基因的重組AAV載體，并初步研究攜帶人VEGF165基因的AAV載體在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)和心肌的表達(dá)情況，為下一步在體治療大鼠心力衰竭的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 第一部分基因重組hVEGF165腺相關(guān)病毒載體和基因重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺相關(guān)病毒載體的包裝目

2、的：應(yīng)用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包裝病毒用載體質(zhì)粒，并以三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法包裝hVEGF165腺相關(guān)病毒和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)腺相關(guān)病毒。 方法：1.質(zhì)粒pcDNA3-hVEGF165質(zhì)粒用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切獲得576bp的hVEGF165cDNA全長(zhǎng)片斷，電泳膠回收備用。pCMV-MCS質(zhì)粒用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，膠回收開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。

3、hVEGF165cDNA片斷和開(kāi)環(huán)pCMV-MCS定向連接，構(gòu)建過(guò)渡質(zhì)粒pCMV-hVEGF165。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。測(cè)序引物上下游分別位于pCMV-hVEGF165質(zhì)粒的beta-globinintron和hGHpA中，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度876bp，電泳結(jié)果和測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 2.為了避免克隆過(guò)程中ITR的丟失引起病毒包

4、裝效率下降，以NOtⅠ酶切質(zhì)粒pCMV-hVEGF165和AAV載體質(zhì)粒pAAV-MCS，行電泳、膠回收含pAAVITR的片斷和pCMV-hVEGF165真核表達(dá)框，兩者連接構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-hVEGF165。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后用雙酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。PCR鑒定引物上下游分別位于pAAV-hVEGF165上下游L-ITR和R-ITR中，共擴(kuò)增2976bp片斷；以N

5、otⅠ和PstⅠ雙酶切pAAV-hVEGF165質(zhì)粒，可以切出約140bp大小的ITR片斷；測(cè)序引物同pCMV-hVEGF165測(cè)序引物。 3.包裝病毒用質(zhì)粒pAAV-EGFP構(gòu)建流程同pAAV-hVEGF165。首先根據(jù)EGFP上下游序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-AGAGTCGACAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’引入SalⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：5’-GAGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA

6、TG-3’引入BglⅡ酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pEGFP-N1為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出720bp兩端分別帶有SalⅠ酶切位點(diǎn)和BglⅡ酶切位點(diǎn)的EGFP片段，SalⅠ和BglⅡ雙酶切PCR產(chǎn)物膠回收后定向連接入用SalⅠ和BglⅡ雙酶切的pCMV-MCS開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA中，獲得pCMV-EGFP質(zhì)粒，電穿孔轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)提取質(zhì)粒后行雙酶切、PCR和測(cè)序等方法鑒定。以NotⅠ酶切質(zhì)粒pCMV-EGFP和A

7、AV載體質(zhì)粒pAAV-MCS，行電泳后膠回收含pAAVITR的片斷和pCMV-EGFP真核表達(dá)框，兩者進(jìn)行連接，構(gòu)建質(zhì)粒pAAV-EGFP。所構(gòu)建質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取菌落克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后PCR產(chǎn)物電泳、酶切和測(cè)序鑒定 4.培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至80-90％融和，取pAAV-hVEGF165(或pAAV-EGFP)、pRC和pHelper電轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝

8、rAAV-hVEGF165或rAAV-EGFP，取電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)72小時(shí)后的HEK293細(xì)胞進(jìn)行氯仿處理——NaCl沉淀—氯仿抽提3個(gè)步驟，分離濃縮和純化rAAV，純化后rAAV通過(guò)AVSachTMELISA法測(cè)定rAAV顆粒滴度，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳考馬斯亮藍(lán)染色觀察檢測(cè)rAAV的衣殼蛋白，將純化后的rAAV病毒樣本磷戊酸負(fù)染電鏡下觀察。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)利用基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pCMV-hVEGF

9、165和pCMV-EGFP過(guò)渡質(zhì)粒，然后再克隆入AAV載體質(zhì)粒構(gòu)建pAAV-hVEGF165和pAAV-EGFP，目的是為了防止pAAV質(zhì)粒中的ITR在操作過(guò)程中的丟失而影響病毒包裝效率。所有質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果、酶切結(jié)果和測(cè)序結(jié)果正確無(wú)誤，并保證了pAAV-hVEGF165和pAAV-EGFP質(zhì)粒中ITR的存在。應(yīng)用電穿孔方法三個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分離純化后獲得高滴度和純度的rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP。

10、包裝純化后獲得病毒滴度可達(dá)到2×1011，SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色可見(jiàn)3條特征性AAV衣殼蛋白條帶，電鏡觀察病毒顆粒均勻，病毒大小20～25nm，呈多面體形態(tài)。重組AAV載體包裝成功，為后繼體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定目的：建立大鼠MSCs和心肌細(xì)胞的培養(yǎng)和純化條件。 方法：1.MSCs的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增：無(wú)菌條件下將4只4-6周雄性Wistar大鼠(120-

11、150克)股骨骨髓腔沖洗液用培養(yǎng)液洗滌2次后，小心吹打成單細(xì)胞懸液，以4×105/cm2接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素，于37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用倒置顯微鏡逐日進(jìn)行觀察。接種72小時(shí)后換液，去除懸浮的造血干細(xì)胞及血細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每三天換液一次。 2.乳鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取15只出生后1-3天的Wistar大鼠，斷頸處死，在裝有75％酒精的燒杯中浸泡5分鐘

12、消毒，在超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌條件下取出大鼠心臟，放在裝有無(wú)菌1×PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用在無(wú)菌1×PBS反復(fù)沖洗后，用眼科剪小心將心臟剪成≤1mm3的碎塊，用0.125％的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，去掉首次消化的上清，收集后面消化的上清，直至心臟碎塊呈現(xiàn)白色纖維狀，用10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，用吸管將細(xì)胞培養(yǎng)液吹打均勻，加入終濃度為100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素后，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放入37℃，5％CO

13、2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)90分鐘后(差速貼壁)，吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，以3×105細(xì)胞/ml接種于新的培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入Brdu至0.1mmol/L，12小時(shí)后更換培養(yǎng)液。以后，每隔3天換液一次。培養(yǎng)3-4天后，細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3.應(yīng)用H-E染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：1.培養(yǎng)出大鼠MSCs，對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，95％以上為大鼠MSCs。 2.培養(yǎng)出乳鼠心肌細(xì)胞，95％為乳鼠心肌細(xì)胞。為下一步實(shí)

14、驗(yàn)奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。 第三部分基因重組野生型hVEGF165腺相關(guān)病毒載體在間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：利用攜帶hVEGF165的基因重組AAV轉(zhuǎn)染MSCs和心肌細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，觀察其在這兩種細(xì)胞的表達(dá)情況。 方法：1.體外培養(yǎng)大鼠MSCs和乳鼠心肌細(xì)胞方法同前。 2.以不同劑量rAAV-EGFP(1×104、1×105、1×106、1×107、2×106v.p./cell)轉(zhuǎn)染大鼠M

15、SCs和乳鼠心肌細(xì)胞96小時(shí)后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白情況。 3.rAAV-hVEGF165以1×107v.p./cell轉(zhuǎn)染MSCs，以1×106v.p./cell轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞，用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定第4、7、10天的培養(yǎng)上清中的VEGF濃度。 結(jié)果：1.rAAV-EGFP轉(zhuǎn)染大鼠MSCs和乳鼠心肌細(xì)胞后96小時(shí)熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，以不同劑量(1×104、1×105、1×106、

16、1×107、2×106)V.p./cell感染細(xì)胞后可見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)比例MSCs為3％，29％，38％，53％，57％；乳鼠心肌為7％，33％，55％，57％，59％。rAAV-EGFP在大鼠MSCs和乳鼠心肌細(xì)胞中可以表達(dá)攜帶的外源基因EGFP。 3.以1×107v.p./cell轉(zhuǎn)染大鼠MSCs和以1×106v.p./cell轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞后，分別在第4、7、10天檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的VEGF濃度，均呈逐漸升高趨勢(shì)，并且顯著高