SAHA促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化及其作用機(jī)制探討.pdf

1、第一部分體外SAHA對MSCs向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)促進(jìn)作用。 目的：探討異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是否促進(jìn)其向心肌細(xì)胞分化，以及SAHA與5氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）是否存在協(xié)同作用。 方法：提取擴(kuò)增大鼠MSCs，分別以SAHA、5-aza或SAHA+5-az

2、a誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞方向分化。在分化過程中以定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）、免疫熒光和Western blot檢測心肌發(fā)育相關(guān)基因和心肌特異性蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.MSCs經(jīng)誘導(dǎo)7天后心肌發(fā)育相關(guān)基因GATA4，NKx2.5和MEF2c的表達(dá)：（1）單純SAHA誘導(dǎo)：GATA4，NKx2.5和MEF2c表達(dá)明顯升高（p<0.05），呈劑量依賴性，在以1μM SAHA誘導(dǎo)組增加最高，與未誘

3、導(dǎo)MSCs比較約增加9-15倍，2μMSAHA誘導(dǎo)組表達(dá)相對降低。（2）單純5-aza誘導(dǎo)：GATA4，NKx2.5和MEF2c表達(dá)僅增高2-4倍（p<0.05）。（3）SAHA+5-aza誘導(dǎo)：GATA4，NKx2.5和MEF2c表達(dá)與單純SAHA誘導(dǎo)相似（p>0.05）。 2.MSCs經(jīng)誘導(dǎo)4周后心肌特異蛋白cTnT的表達(dá)：（1）單純SAHA誘導(dǎo)：免疫熒光檢測可見細(xì)胞內(nèi)較密集的綠色點(diǎn)狀熒光；Western blot檢測1μM

4、 SAHA誘導(dǎo)組cTnT增加最高（p<0.05），與未誘導(dǎo)MSCs比較約增加8倍，在誘導(dǎo)濃度為2μM時(shí)下降。（2）單純5-aza誘導(dǎo)：免疫熒光檢測可見細(xì)胞內(nèi)稀疏綠色點(diǎn)狀熒光，Western blot檢測cTnT僅較未誘導(dǎo)MSCs升高1.3倍左右（p>0.05）。（3）SAHA+5-aza誘導(dǎo)：免疫熒光檢測可見細(xì)胞內(nèi)較密集的綠色點(diǎn)狀熒光；Western blot檢測cTnT升高與單純SAHA誘導(dǎo)相似（p>0.05）。 結(jié)論：

5、 1、SAHA可促進(jìn)MSCs向心肌細(xì)胞分化，使MSCs中心肌發(fā)育相關(guān)基因和特異性蛋白表達(dá)明顯升高。其誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化效果強(qiáng)于單純5-aza誘導(dǎo)。 2、在MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中未發(fā)現(xiàn)SAHA和5-aza的協(xié)同作用。第二部分體外SAHA促M(fèi)SCs向心肌細(xì)胞分化的組蛋白乙?；饔脵C(jī)制。 目的：探討SAHA體外誘導(dǎo)MSCs是否通過升高心肌發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子DNA上結(jié)合組蛋白乙?；絹泶龠M(jìn)其表達(dá)，并探討這些啟

6、動(dòng)子區(qū)組蛋白高乙?；欠衽c組蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase4，HDAC4）抑制有關(guān)。 方法：于1μM SAHA誘導(dǎo)MSCs7天后收集細(xì)胞，以乙酰化H3和HDAC4抗體分別做染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP），以心肌發(fā)育相關(guān)基因第一外顯子前1000bp設(shè)計(jì)引物，qPCR檢測沉淀后DNA中心肌發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA量的變化。 結(jié)果：SAHA誘

7、導(dǎo)后MSCs中以乙?；M蛋白H3抗體ChIP沉淀的GATA4、MEF2c和NKx2.5啟動(dòng)子區(qū)DNA分別比未誘導(dǎo)MSCs增加約3倍、1.4倍和2倍（p<0.05），而以HDAC4抗體沉淀的GATA4、MEF2c和NKx2.5啟動(dòng)子區(qū)DNA分別比未誘導(dǎo)MSCs下降約0.41倍、0.31倍和0.43倍（p<0.05）。 結(jié)論： 1、SAHA誘導(dǎo)后MSCs的GATA4、MEF2c和NKx2.5表達(dá)增強(qiáng)可能與SAHA誘導(dǎo)后這些基

8、因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；皆黾樱せ钷D(zhuǎn)錄有關(guān)。 2、GATA4、MEF2c和NKx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；缴呖赡芘cHDAC4抑制有關(guān)。這可能也是SAHA誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞特異性分化的乙?；饔脵C(jī)制之一。第三部分SAHA對MSCs移植阿霉素心力衰竭大鼠心功能的影響。 目的：探討SAHA誘導(dǎo)后MSCs移植治療心力衰竭大鼠模型是否比單純MSCs移植有更加明顯的促進(jìn)心功能改善的作用。 方法：構(gòu)建阿霉素心力

9、衰竭大鼠模型，分別將MSCs、SAHA誘導(dǎo)7天的MSCs移植入大鼠心肌組織內(nèi)，三周后心臟彩色超聲心動(dòng)圖（ultrasonic cardiogram，UCG）檢測其心功能變化，采用左室的射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）指標(biāo)評(píng)價(jià)移植后大鼠心功能改善情況。 結(jié)果：MSCs組EF由移植前的65.92±2.98上升至移植后的73.25±3.58，F(xiàn)S由32.2

10、5±1.66上升至37.46±3.12。SAHA誘導(dǎo)MSCs組EF由移植前的66.04±2.02上升至移植后的75.13±2.05，F(xiàn)S由32.29±0.96上升至38.87±1.82。MSCs組和SAHA誘導(dǎo)MSCs組移植后與移植前心功能比較EF和FS均有明顯改善（p<0.05），但MSCs組和SAHA誘導(dǎo)MSCs組之間移植后心功能比較EF和FS無明顯差異（p>0.05）。 結(jié)論：單純MSCs和SAHA誘導(dǎo)MSCs移植阿霉素大