雙突變型HIF1α腺病毒構建及其對骨髓間充質干細胞增殖和向心肌細胞分化的影響.pdf

1、心血管疾病仍然是人體健康的一大殺手。近年來研究發(fā)現，成人心臟存在心肌有絲分裂和心肌前體細胞，但心肌細胞的大量死亡還是會發(fā)生心力衰竭，再生藥物治療成為退行性疾病最有潛力的治療方法。 干細胞因為有較好的可塑性而成為現代科學研究的焦點。由于MSC容易獲得，具有自我復制能力，不會受到倫理學的限制，在體外粘附培養(yǎng)并不斷擴增，以及最近報道的具有向心肌細胞分化的潛能。MSC被認為是最有希望用來恢復損傷心肌的再生細胞。 已有大量研究表明

2、， MSC能夠明顯改善心功能，其中可能的原因是MSC向心肌細胞分化，使得有功能的心肌細胞增多，從而增加心肌收縮力。體外研究發(fā)現，細胞一細胞間的物理接觸或心肌細胞微環(huán)境可以促進MSC向心肌細胞分化，但是，究竟是什么在MSC向心肌細胞分化過程中起決定性作用，目前并不清楚。 在心?；蛐乃游飳嶒災Ｐ椭校琈SC能向心肌細胞分化。同時有研究發(fā)現，經過低氧/復氧處理的心肌細胞條件培養(yǎng)基能夠誘導MSC表達MHC和TnT等心肌標志物。這些情況下

3、，MSC向心肌細胞分化都是在低氧環(huán)境中發(fā)生，低氧環(huán)境可能與MSC向心肌細胞分化有關。同時，Linask及其同事證明心肌細胞分化是在低氧環(huán)境中發(fā)生。低氧環(huán)境是否會促進MSC向心肌細胞分化，其分子機制怎樣并不清楚。 低氧環(huán)境下，會產生一種重要的轉錄激活因子HIF-1，它的半衰期大約5分鐘。HIF-1能激活多種因子的轉錄表達，其中也包括TGF-β。 TGF-β是一類具有多種生物學活性的細胞因子，參與調節(jié)細胞的增殖、分化、發(fā)育和

4、凋亡等多種生命活動，現已有研究發(fā)現TGF-β1能誘導胚胎干細胞向心肌細胞分化。 近年來發(fā)現，Smads蛋白家族是介導TGF-β家族的下游信號通道蛋白，TGF-β1通過Smad4誘導干細胞向心肌細胞分化。但在MSC與CMC共培養(yǎng)中TGF-β1/Smad4是否被激活并參與MSC向CMC分化?目前國內外尚無文獻報道。 本研究的目的是采用攜帶HIF-1α基因的腺病毒，研究HIF-1α對MSC增殖和與心肌細胞共培養(yǎng)的MSC的影響，

5、探討MSC向心肌細胞分化可能的分子機制，觀察TGF-β1/Smad4信號通路在其中的作用。研究結果將為低氧環(huán)境對MSC向心肌細胞分化的影響奠定理論基礎，為HIF-1α基因治療和MSC移植治療在臨床的應用提供理論依據。為此我們設計并完成了以下實驗。 目的：采用分子生物學技術構建攜帶雙突變型HIF-1α的腺病毒，研究Ad-HIF1α．Ala402-Ala564對MSC增殖的影響，以及HIF-1α對與心肌細胞共培養(yǎng)的MSC向心肌細胞分

6、化的影響。 方法：采用定點突變技術及體外連接方法重組腺病毒Ad-HIF1α-Ala402-Ala564，TICD50法測定病毒滴度，Westem鑒定Ad-HIF1α的功能；第二部分，實驗分為三組：HIF-1α組(MSC+Ad-HIF1α)、LacZ組(MSC+Ad—LacZ)、Control組(MSC+PBS)，每組設6個復孔，計數病毒(MOI=330)感染后1、2、4、7、10、15天各組的MSC數目；第三部分，實驗分為四組：

7、HIF-1α組(MSC+CMC+Ad．HIF1α)、LacZ組(MSC+CMC+Ad-LacZ)、Sham組(MSC+CMC+PBS)、MSC+HIF-1α組(MSC+Ad-HIF1α)，每組設4個復孔，按MSC：CMC為1：2的比例共培養(yǎng)MSC和OCMC，共培養(yǎng)24小時后感染病毒(MOI=100)，病毒感染后7天，免疫細胞化學分析共培養(yǎng)的MSC表達心肌細胞特異性標志物cTnT的情況，RT-PCR分析各組細胞HIF-1α、TGF-β1、

8、Smad4、NKx2.5、GATA-4的mRNA表達量，并做細胞分化率與他們之間的相關分析。 結果： pShuttle2-HIF1α-Ala564質粒上的定點突變成功(Pro-402突變?yōu)锳la-402)，構建了表達HIF-1α蛋白的高滴度重組腺病毒Ad-HIF-α-Ala402-Ala564，滴度達2×109PFU/ml，與Ad-HIF1α．Ala564和Ad-LacZ相比，它使HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性和表達量增加，分別為p＜

9、0.05和p＜0.01，具有統(tǒng)計學意義。病毒以MOI值為330感染MSC時，細胞生長狀態(tài)良好，在感染后第7天，HIF-1α組較Control組能明顯促進MSC增殖，p＜0.05；LacZ組較Control組相比細胞數目少，p＜0.05，均具有統(tǒng)計學意義。并且，HIF-1α增加共培養(yǎng)的MSC向CMC分化，其分化率可達32.68±6.52％，而LacZ組和Sham組僅為8.28±0.09％和10.25±2.20％，單純MSC組僅0.32±0

10、.05％，HIF1α組與LacZ組和Sham組相比，p值均小于0.05，具有統(tǒng)計學意義，LacZ組和Sham組間無顯著性差異，MSC組與Sham組相比，p＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。做相關分析得到，HIF-1 α、TGF-β1、Smad4、NKx2.5、GATA-4的mRNA水平與心肌細胞分化率的決定系數R2分別為：0.8543、0.7059、0.7882、0.8083、0.7736。 結論：HIF-1α的Pro-402突變后，