仿生電刺激在離體心肌細胞誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化中的作用.pdf

1、[目的] 研究仿生電刺激對大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的誘導作用及強度。 [方法] 1.按不同接種密度、血清濃度、首次換液時間及PH值分組接種MSCs，10天后進行活細胞計數(shù)，探討其適宜的培養(yǎng)條件，采用MTT法繪制細胞的生長曲線，免疫組織化學化檢測MSCs CD44、CD34表達情況，流式細胞儀檢測MSCs生長周期。 2.采用兩種不同次序的胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化方法（方法10.125％胰酶+

2、0.1％Ⅱ型膠原酶混合液逐次消化心肌組織；方法20.1％Ⅱ型膠原酶單獨消化心肌組織數(shù)次基礎上再單用0.125％胰酶逐次消化心肌組織），分離新生大鼠的心肌細胞，比較兩種消化方法獲得心肌細胞數(shù)量及存活率的差別，同時進行心肌細胞體外培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學變化，并以細胞免疫熒光進行心肌細胞純度鑒定。 3.將骨髓間充質干細胞（經(jīng)DAPI標記）與心肌細胞按固定比例共同培養(yǎng)（MSCs/心肌細胞共培養(yǎng)體系），按是否給予仿生電刺激分為非電刺激組和電刺

3、激組，刺激組每日給予仿生電刺激2h，頻率0.5Hz、脈寬5ms、電壓10V（電流強度20μA），每組又以實驗干預培養(yǎng)時間（3、5、7天）分為三個亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）。分別于實驗的第3、5、7天觀察各組細胞生長情況，細胞免疫熒光方法檢測骨髓間充質干細胞cTnT的表達情況。 4.取傳代生長狀態(tài)良好的MSCs，吸棄DMEM低糖培養(yǎng)液，換上含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液；給予仿生電刺激的為實驗干預組（每天給予電刺激2h，刺激7天），沒有

4、給予仿生電刺激的為實驗對照組；仿生電刺激的頻率為0.5Hz，脈寬5ms，按照刺激電壓強度5V、10V、20V（分別對應的電流強度為10μA、20μA、40μA）分為三個亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）；電刺激干預7天后，分別取實驗干預各亞組細胞和對照組細胞行cTnT抗體免疫熒光染色，觀察各組細胞有無出現(xiàn)心肌細胞特異性肌鈣蛋白的表達。 [結果] 1.MSCs貼壁呈纖維樣生長，細胞較佳接種密度為5×105/c㎡，合適血清濃度為10％，較

5、合適首次換液時間為48h，培養(yǎng)液較佳的PH值為7.2左右；MSCs經(jīng)歷生長停滯期、對數(shù)生長期、平臺期；MSCs膜上存在CD44陽性表達，無CD34表達；流式細胞儀檢測MSCs大部分處于靜止G0/G1期。 2.兩種不同次序消化方法心肌細胞分離良好，收獲細胞數(shù)量及存活率高，方法2細胞存活率高于方法1；分離的細胞體外培養(yǎng)可貼壁搏動生長，免疫熒光顯示培養(yǎng)的心肌細胞純度達95％以上。 3.離體心肌微環(huán)境誘導MSCs中，仿生電刺激組

6、細胞較非電刺激組生長良好，實驗第5天非電刺激組骨髓間充質干細胞沒有cTnT表達，電刺激組有少數(shù)骨髓間充質干細胞出現(xiàn)cTnT表達。實驗第7天非電刺激組和電刺激組MSCs均有cTnT表達，電刺激組骨髓間充質干細胞cTnT陽性細胞率高于非電刺激組。 4.仿生電直接刺激骨髓間充質干細胞7天后，倒置顯微鏡下觀察，各實驗干預組及實驗對照組的MSCs細胞均明顯鋪開生長，形態(tài)、大小不一；分別取實驗干預的各亞組細胞（按刺激電壓強度5v、10v、2