CpG-ODN對兩種病原菌分別誘導的動物乳腺炎乳腺的保護研究.pdf

1、本文通過采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別建立了大鼠的乳腺炎動物模型；并通過免疫調節(jié)劑CpG-ODN探索了其對大鼠乳腺局部、整體的防御體系及炎癥相關因子的影響，并初步探討了CpG-ODN的作用機制；并在此基礎上將CpG-0DN應用于山羊，進一步印證了其對乳腺健康的有效保護作用及對乳腺炎的預防作用，為乳腺炎的生物防治提供了一條新思路。 1 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別誘導的大鼠實驗性乳腺炎模型的建立 30只飼喂基礎日

2、糧的泌乳初期SD雌性大鼠隨機分成五組(n=6)，產后72 h分別用滅菌0.01 mol·L<'-1>，pH 7.2 PBS(CON組)、低濃度(2×10<'5>CFU·mL<'-1>，SL組)和高濃度(2×10<'12>CFU·mL<'-1>，SH組)金黃色葡萄球菌，低濃度(2×10<'5>CFU·mL<'-1>，EL組)和高濃度(2×10<'12>CFU·mL<'-1>，EH組)大腸桿菌各100 μL，經乳頭管灌注到大鼠第四對乳腺內(

3、雙側)，灌注后24 h頸靜脈放血處死。取部分乳腺組織進行組織學觀察。SL和EL組的乳腺病變不明顯，僅見腺泡腔內乳汁分泌量減少，SH組和EH組的乳腺腺泡結構破壞嚴重，腺泡腔內有脫落的上皮細胞，并有較多的嗜中性粒細胞(Polymorpho-nuclearneutrophils，PMN)浸潤。SH和EH組乳腺組織中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-

4、6)水平均有顯著(P<0.05)升高，血清TNF-α和IL-6水平無顯著性變化。SH和EH組乳腺組織N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)活性均極顯著(P<0.01)升高，血清NAGase活性極顯著(P<0.01)下降。SL和EL組的上述指標均無顯著性變化。由結果可知2×10<'12>CFU·mL<'-1>的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別成功地誘發(fā)了大鼠的乳腺炎。

5、 2 肌肉注射CpG-ODN對金黃色葡萄球菌誘導的大鼠實驗性乳腺炎乳腺的保護作用研究 72只泌乳初期SD雌性大鼠隨機分成對照組和實驗組(n=36)，對照組產后0 h于左后腿脛骨前肌內注射100μL0.01mol·L<'-1>，pH 7.2 PBS；實驗組肌注CpG-ODN 200μg／只，72 h后經乳導管灌注2×10<'12>CFU·mL<'-1>金黃色葡萄球菌各100μL／側到第四對乳腺(兩側)內。分別于灌注前(定義

6、為0 h)，灌注后8，16，24，48和72 h(n=6)頸靜脈放血處死。組織學觀察顯示乳腺腺泡內PMN浸潤高峰出現(xiàn)在感染后24 h，感染初 于灌注前(定義為0 h)，灌注后8，16，24，48和72 h(n=6)頸靜脈放血處死。組織學觀察顯示大鼠感染后16 h為乳腺腺泡內嗜中性粒細胞PMN浸潤高峰，實驗組PMN在感染初期較對照組浸潤迅速，而感染后72 h實驗組乳腺腺泡內已無浸潤，而對照組仍有少量浸潤。乳腺組織大腸桿菌數(shù)在感染后

7、16 h上升至最高，CpG-ODN能顯著降低感染后16，24和48 h乳腺組織大腸桿菌數(shù)。CpG-ODN能極顯著提高感染前乳腺組織中IL-2水平。兩組乳腺組織IL-6同在感染后16 h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染后16 h乳腺組織IL-6水平。對照組和實驗組TNF-α分別在感染后16和8 h達最高。乳腺組織和血清MPO均有顯著上升，CpG-ODN能極顯著提高感染前 后乳腺組織中MPO水平，對感染后24和48 h血清中

8、MPO也有顯著提高作用。實驗組乳腺組織NAGase無顯著變化。半定量RT-PCR結果顯示，兩組乳腺組織CpG-ODN特異性受體TLR-9 mRNA表達水平同在感染后16 h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染后8和16 h乳腺組織中TLR-9 mRNA表達水平。上述結果表明CpG-ODN可通過提高乳腺組織TLR-9 mRNA表達水平，加速炎癥初期血液PMN向乳腺組織的快速浸潤，促進IL-2和IL-6的產生，提高MPO的活力，減少乳腺

9、組織大腸桿菌數(shù)量，減輕炎癥介質對細胞的損傷并縮短炎癥過程，證實了CpG-ODN對大腸桿菌誘發(fā)的大鼠實驗性乳腺炎的乳腺有保護作用。4 乳導管灌注CpG-ODN對金黃色葡萄球菌誘導的山羊實驗性乳腺炎乳腺的保護作用研究 選擇同處于泌乳初期的睢寧白山羊6頭，體重為30～40 kg。產后第5天早上擠奶后，于右乳區(qū)經乳導管灌注10μg-kg<'-1>CpG-ODN，左乳區(qū)則通過乳導管灌入等體積的滅菌PBS作為對照，灌注后第3天按同等劑量進

10、行二次灌注，二次灌注后第2天早上擠奶后，于左右乳區(qū)經乳導管灌注2×10<'9>CFU·mL<'-1>金黃色葡萄球菌各3 mL，分別于灌注細菌前(定義為0 h)，灌注后8，16，24，48和72 h收集左右乳區(qū)乳汁，灌注金葡菌72 h后，處死動物，取乳腺組織。臨床癥狀觀察顯示，乳腺內灌注3 mL 2×10<'9>CFU.mL<'-1>金黃色葡萄球菌能迅速誘導山羊典型的急性乳腺炎癥狀。組織學觀察顯示感染金葡菌后72 h乳腺腺泡內仍有PMN浸

11、潤，但實驗乳區(qū)明顯減少。乳汁金葡菌數(shù)同在感染后24 h上升至最高，CpG-ODN能顯著降低各個時間點乳汁金葡菌數(shù)。CpG-ODN能顯著提高感染前乳汁IL-2水平。乳汁IL-6水平同在感染后24h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染后24 h乳汁IL-6水平。對照和CpG-ODN處理乳區(qū)乳汁TNF-α水平分別在感染后24和16 h上升至最高，其中在感染后24 h實驗乳區(qū)較對照下降41.91％(P<0.05)。乳汁MPO水平同在感染后2

12、4h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染后8h、16h和48h乳汁MPO水平。乳汁NAGase水平同在感染后16 h達最高(P<0.01)，CpG-ODN能顯著提高感染后8 h乳汁NAGase水平。對照和CpG-ODN處理乳區(qū)乳汁血清白蛋白水平分別在感染后24 h和16 h上升至最高(P<0.01)，在感染初期的第8 h實驗乳區(qū)較對照上升了40.63％(P<0.05)，而在感染后24 h實驗較對照下降了25.98％(P<0.01)。

13、半定量RT-PCR顯示CpG-ODN能顯著提高感染后72 h乳腺組織TLR-9 mRNA表達量。提示CpG-ODN可通過提高山羊乳腺組織TLR-9 mRNA表達水平，提高乳汁IL-2和IL-6水平，加速并促進乳汁TNF-α的釋放，從而減少了乳汁中金葡菌數(shù)量，減輕了炎癥介質對細胞的損傷，同時對縮 短炎癥過程也有一定的作用。證實了CpG-ODN對金葡菌感染誘發(fā)的山羊乳腺炎的乳腺有保護作用。5乳導管灌注CpG-ODN對大腸桿菌誘導的山

14、羊實驗性乳腺炎乳腺的保護作用研究 選擇同處于泌乳初期的睢寧白山羊6頭，體重為30-40kg。產后第5天早上擠奶后，于右乳區(qū)經過乳導管灌注10μg·kg<'-1>CpG-ODN，左乳區(qū)則通過乳導管灌入等體積的滅菌PBS作為對照，灌注后第3天按同等劑量進行二次灌注，二次灌注后第2天早上擠奶后，于左右乳區(qū)經乳導管灌注2×10<'9>CFU·mL<'-1>大腸桿菌各3mL，分別于灌注細菌前(定義為0h)，灌注后8，16，24，48和7

15、2 h收集左右乳區(qū)乳汁，灌注大腸桿菌72h后，處死動物，取乳腺組織。臨床癥狀觀察顯示，乳腺內灌注3mL2×10<'9>CFU·mL<'-1>的大腸桿菌能迅速誘導山羊典型的急性乳腺炎癥狀。組織學觀察顯示感染大腸桿菌后72h乳腺腺泡內仍有少量PMN浸潤，但實驗乳區(qū)已無浸潤。乳汁大腸桿菌數(shù)同在感染后16h上升至最高，CpG-ODN能顯著降低感染16h后各個時間點乳汁大腸桿菌數(shù)。CpG-ODN能顯著提高感染前乳汁IL-2水平。乳汁IL-6水平在

16、感染后16h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染前乳汁IL-6水平，而在感染后24h實驗乳區(qū)較對照下降了33.78％(P<0.05)。乳汁TNF-α水平在感染后16h上升至最高，其中在感染后24h實驗乳區(qū)較對照下降35.07(P<0.01)。乳汁MPO水平同在感染后16h上升至最高，CpG-ODN能顯著提高感染后8h和16h乳汁MPO水平。乳汁NAGase水平同在感染后16h達最高(P<0.01)，CpG-ODN能顯著提高感染后8h

17、乳汁NAGase水平。乳汁血清白蛋白水平同在感染后16h上升至最高(P<0.01)，其中在感染初期的第8h實驗乳區(qū)較對照上升了40．63％(P<0.05)，而在感染后24h實驗較對照下降了56.160％(P<0.05)。半定量RT-PCR顯示感染后72h實驗乳區(qū)乳腺組織TLR-9 mRNA表達量較對照組有顯著上升。提示CpG-ODN可通過提高乳腺組織CpG-ODN特異性受體TLR-9 mRNA表達水平，提高乳汁IL-2和IL-6水平，減