原料乳中兩種病原菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、近年來，隨著乳制品行業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的快速發(fā)展，由乳及乳制品的安全問題所引發(fā)的乳源性疾病，特別是細(xì)菌性食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。因此，對(duì)乳源性病原菌的檢測(cè)研究受到了前所未有的重視。大量研究結(jié)果表明金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和致病性大腸桿菌(pathogenic Escherichia coli)是污染原料乳的兩種最常見的人畜共患病病原菌，它們通過引發(fā)乳及乳制品的腐敗變質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致人畜共患病和人類食物中毒的發(fā)生。

2、為此，加強(qiáng)原料乳及乳制品中金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的檢測(cè)對(duì)預(yù)防和控制乳源性疾病的發(fā)生和流行顯得至關(guān)重要。本研究在建立可同步檢測(cè)金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的雙重PCR方法的基礎(chǔ)上，對(duì)合肥地區(qū)采集的新鮮原料乳以及市售乳制品進(jìn)行上述兩種病原菌檢測(cè)，以期探明原料乳及乳制品的污染狀況。
　　 首先，建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的單一PCR方法。選取金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因和致病性大腸桿菌粘附素K99基因作為

3、檢測(cè)目的基因，根據(jù)nuc基因和K99基因的保守區(qū)序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性引物。在其他因素不變的條件下，通過對(duì)引物濃度、模板濃度、退火溫度和Mg2+濃度的摸索，確定了金黃色葡萄球菌單一PCR檢測(cè)方法的最佳條件是：在25μL反應(yīng)體系中加入10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs0.5μL，Mg2+(25mM)1.5μL，DNA模板3.0μL，引物(20 pmol)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL

4、)0.3μL，雙蒸水16.2μL。各成分混合后進(jìn)行95℃預(yù)變性10min，94 ℃變性45s；58 ℃退火30s；72 ℃延伸30s，共循環(huán)30次，最后72 ℃后延伸5min。致病性大腸桿菌單一PCR檢測(cè)方法的最佳條件是將退火溫度降至56 ℃，其余條件同上。
　　 其次，建立了可同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌的雙重PCR方法。在單一PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、模板濃度和退火溫度在4個(gè)水平

5、上進(jìn)行L16（44）優(yōu)化試驗(yàn)，確定了雙重PCR方法的最佳條件為：25μL反應(yīng)體系中，10×PCRBuffer 2.5μL，dNTPs 0.5μL，Mg2+(25mM)2.5μL，DNA模板終濃度比為1:1、引物終濃度比為1:3，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，雙蒸水17.2μL，各反應(yīng)物混合均勻后于95℃預(yù)變性10min，94 ℃變性45s；58 ℃退火30s；72 ℃延伸30s，共循環(huán)30次，最后72 ℃后延伸5min。

6、
　　 再次，利用建立的雙重PCR方法檢測(cè)人工模擬樣品，驗(yàn)證其實(shí)際應(yīng)用的可行性。使用微孔濾膜過濾富集樣品中的菌體后，采用改良DNA提取法抽提模板進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示無需對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng)，即可從富集后的樣品中檢測(cè)出目的基因。從樣品的富集到PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，整個(gè)過程大約需要6h左右，且兩種病原菌的最低檢測(cè)限均達(dá)到102CFU/mL。表明建立的雙重PCR方法具有較好的應(yīng)用可行性。
　　 最后，采用建立的雙重PCR方法對(duì)從

7、合肥地區(qū)采集的152份新鮮原料乳和50份市售乳制品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。結(jié)果從50份市售乳制品中均未檢測(cè)出兩種病原菌。在所檢測(cè)的152份新鮮原料乳中，雙重PCR方法和國(guó)標(biāo)法檢出金黃色葡萄球菌的陽性率分別為75.00％和36.84％，致病性大腸桿菌的陽性率分別為47.37％和8.55％，同時(shí)檢出兩種病原菌的陽性率分別為38.16％和4.61％。兩種方法檢出金黃色葡萄球菌或致病性大腸桿菌的符合率分別為61.84％或61.18％