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文檔簡(jiǎn)介
1、RhoA作為小分子GTP結(jié)合蛋白,是各種細(xì)胞功能的分子開(kāi)關(guān)包括細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂和基因表達(dá)等。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RhoA的效應(yīng)子,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,具有廣泛的生物學(xué)功能。ROCK有兩種亞型,分別命名為ROCKⅠ和ROCKⅡ。ROCKⅠ主要在非神經(jīng)組織中高表達(dá),而ROCKⅡ是主要在腦組織中表達(dá)。細(xì)胞和分子生物學(xué)最新研究進(jìn)展表明RhoA/ROCK信號(hào)通路廣泛參與心血管系統(tǒng)的各種生理
2、病理進(jìn)程,例如心肌細(xì)胞凋亡,心肌肥厚,心肌梗死后心室重塑等。因此,抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路可能是治療包括高血壓,動(dòng)脈粥樣硬化,糖尿病和肥厚性心衰等許多心血管疾病的有效辦法。
法舒地爾是臨床最常用的特異性ROCK抑制劑,能有效阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,法舒地爾可以降低缺血再灌注的損傷程度。對(duì)于慢性高血壓導(dǎo)致的充血性心衰大鼠,法舒地爾可降低心肌梗死后梗死面積和心肌纖維化程度。此外,根據(jù)臨床觀(guān)察,法
3、舒地爾能顯著改善心絞痛患者心肌缺血程度,并且不影響心率和血壓,具有良好的耐受性。這表明RhoA/ROCK信號(hào)通路參與了人類(lèi)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,我們使用法舒地爾作為工具藥,研究了不同動(dòng)物模型心肌病的發(fā)病機(jī)制,及RhoA/ROCK信號(hào)通路在這些機(jī)制中的調(diào)控作用,并探討了在心血管疾病治療方面,法舒地爾新的應(yīng)用潛力。
本研究主要內(nèi)容包括:(1)RhoA/ROCK信號(hào)通路在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌病中的作用及法舒地爾的干預(yù)
4、效應(yīng);(2)RhoA/ROCK與JNK和ERK1/2信號(hào)通路的相互對(duì)話(huà),參與異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭;(3)RhoA/ROCK信號(hào)通路干預(yù)大鼠甲亢性心肌病的發(fā)病機(jī)制。
第一部分 RhoA/ROCK信號(hào)通路在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌病中的作用及法舒地爾的干預(yù)效應(yīng)
目的:研究RhoA/ROCK信號(hào)通路在ADR誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制中的作用及法舒地爾的干預(yù)效應(yīng)
方法:清潔級(jí)雄性SD大鼠60只,
5、體重200~240g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,在室溫20℃~22℃,空氣濕度45%~55%的條件下飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組(CONT)、ADR模型組(ADR)、卡托普利組(CAP+ADR)、法舒地爾低劑量組(FASL+ADR)、法舒地爾高劑量組(FASH+ADR),每組12只。FASL+ADR組和FASH+ADR組分別給予法舒地爾2mg·kg-1·d-1和10mg·kg-1·d-1,分兩次腹腔注射給藥,連續(xù)6d;CAP+A
6、DR組給予卡托普利30mg·kg-1·d-1灌胃,連續(xù)6d;ADR組、空白對(duì)照組給予等容積生理鹽水。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第四天腹腔注射ADR10mg·kg-1·d-1。各組大鼠注射ADR后,全部存活,死亡率為0。停藥24h后檢測(cè)下列指標(biāo):(1)血流動(dòng)力學(xué):包括心率(heart rate,HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ve
7、ntricular end diastolic pressure,LVEDP)、左心室室內(nèi)壓最大上升速率(maximum ascending rate of left ventricularpressure,+dp/dtmax)、左心室室內(nèi)壓最大下降速率(maximum descendingrate of left ventricular pressure,-dp/dtmax)等;(2)組織學(xué)檢測(cè):包括HE染色觀(guān)察心肌的組織病理學(xué)變化和
8、透射電鏡觀(guān)察心肌超微結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化;(3)血液生化指標(biāo):血清中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK)的活性測(cè)定;(4)RT-PCR測(cè)定ROCKⅠ,c-fos,c-jun,c-FLIPL mRNA的表達(dá);(5)Western Blotting測(cè)定bax,bcl-2蛋白的表達(dá);(6)ELISA試劑盒檢測(cè)NF-κB的活性。
結(jié)果:
1 法舒地爾對(duì)左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響
與CONT比較,AD
9、R模型組HR顯著升高(從327.5±30.4升至408.7±34.8bpm,p<0.05);LVEDP也顯著升高(從6.7±1.64升至18.6±5.15mmHg,p<0.05)。此外,ADR模型組的LVSP顯著降低(從144.6±26.4降至99.5±21.7mmHg,p<0.05);±dp/dtmax也顯著降低(+dp/dtmax從6865±1451降至4509±1524mmHg/s,p<0.05;-dp/dtmax從6024±12
10、97降至3890±813mmHg/s,p<0.05)。LVSP和±dp/dtmax對(duì)左心室前負(fù)荷和后負(fù)荷都敏感,血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變表明ADR模型組左心室功能紊亂,造模成功。與ADR模型組相比,CAP+ADR組HR顯著下降(從408.7±34.8降至332.4±57.1bpm,p<0.05);LVEDP顯著降低(從18.6±5.15降至12.7±2.55mmHg,p<0.05);而LVSP顯著升高(從99.5±21.7升至129.2±28
11、.1mmHg,p<0.05);±dp/dtmax顯著升高(+dp/dtmax從4509±1524升至6257±1402mmHg/s,p<0.01;-dp/dtmax從3890±813升至5334±1372mmHg/s,p<0.05)。與ADR模型組相比,F(xiàn)ASL+ADR組HR顯著降低(從408.7±34.8降至338.4±45.3bpm,p<0.05);LVEDP顯著降低(從18.6±5.15降至14.8±3.21mmHg,p<0.05
12、);但是LVSP顯著升高(從99.5±21.7升至114.8±16.5mmHg,p<0.05);±dp/dtmax顯著升高(+dp/dtmax從4509±1524升至5937±1195mmHg/s,p<0.01;-dp/dtmax從3890±813升至5104±1380mmHg/s,p<0.05)。與ADR模型組相比,F(xiàn)ASH+ADR組HR顯著降低(從408.7±34.8降至336.2±33.2bpm,p<0.05);LVEDP顯著降低
13、(從18.6±5.15降至12.1上2.82mmHg,p<0.05),而LVSP顯著升高(從99.5±21.7升至122.4±21.3mmHg,p<0.05);±dp/dtmax顯著升高(+dp/dtmax從4509±1524升至6158±1421mmHg/,p<0.05;-dp/dtmax從3890±813升至5545±1050mmHg/s,p<0.05)。
2 法舒地爾對(duì)左心室組織結(jié)構(gòu)的影響
在光鏡和透射
14、電子顯微鏡下觀(guān)察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu),顯示正常心肌細(xì)胞肌原纖維排列整齊,明暗帶清晰。橢圓形細(xì)胞核,核膜完整,含有豐富的線(xiàn)粒體。ADR模型組肌纖維呈波浪狀,局部斷裂溶解,余者心肌細(xì)胞萎縮明顯,心肌線(xiàn)粒體腫脹,Z線(xiàn)扭曲變窄,部分消失,肌原纖維溶解斷裂。與ADR模型組相比,CAP+ADR,F(xiàn)ASL+ADR和FASH+ADR組大鼠心肌形態(tài)特征有明顯好轉(zhuǎn),并且法舒地爾對(duì)ADR誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的抑制呈劑量依賴(lài)性。
3 法舒地爾對(duì)血清中乳酸脫
15、氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK)的活性影響
與正常大鼠比較,模型組大鼠血清中LDH和CPK活性明顯升高??ㄍ衅绽蚍ㄊ娴貭柼幚砗?,活性顯著降低(p<0.05或p<0.01),但不能達(dá)到正常組水平。
4 法舒地爾對(duì)左心室ROCKⅠ,c-fos,c-jun和c-FLIPLmRNA表達(dá)的影響mRNA表達(dá)顯著降低(p<0.01)。與CONT比較,ADR模型組的c-fos/GAPDH和c-jun/GAPDH mR
16、NA水平顯著升高(p<0.01),而c-FLIPL/GAPDH mRNA水平顯著降低(p<0.01)。與ADR模型組比較,CAP+ADR組c-fos mRNA水平顯著降低(p<0.01),而FASL+ADR和FASH+ADR組的c-fos mRNA變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與ADR模型組比較,CAP+ADR,F(xiàn)ASL+ADR和FASH+ADR組c-jun mRNA水平顯著降低(p<0.01)。與ADR模型組比較,CAP+ADR組c-FLIPL
17、 mRNA表達(dá)略有升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而FASL+ADR和FASH+ADR組c-FLIPL mRNA表達(dá)顯著升高(p<0.05)。
5 法舒地爾對(duì)左心室bax和bcl-2蛋白表達(dá)的影響
與CONT比較,ADR模型組bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(p<0.01),而bax蛋白表達(dá)顯著升高(p<0.01)。給藥后,與ADR模型組比較,CAP+ADR,F(xiàn)ASL+ADR和FASH+ADR組bax蛋白表達(dá)顯著降低(p<0
18、.01),而bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(p<0.05或p<0.01)。bax/bcl-2的比值是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因子,我們的結(jié)果顯示阿霉素處理大鼠后,bax/bcl-2的比值升高到743%。法舒地爾可以降低bax/bcl-2的比值,并呈劑量依賴(lài)性
6 法舒地爾對(duì)左心室NF-κ13活性的影響
用ELISA試劑盒檢測(cè)ADR誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚中左心室NF-κB的活性,結(jié)果顯示,ADR模型組NF-κB活性是CONT組的
19、4倍數(shù)(417%,p<0.01)??ㄍ衅绽头ㄊ娴貭柨梢燥@著減弱NF-κB的活性。
小結(jié):在ADR誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚的發(fā)病過(guò)程中,RhoA/ROCK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控c-jun,c-fos,bax,bcl-2和NF-1B的活性而參與其病理過(guò)程。法舒地爾通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活而改善ADR誘導(dǎo)的心力衰竭,緩解超負(fù)荷心臟的心肌肥厚。
第二部分 RhoA/ROCK與JNK和ERK1/2信號(hào)通路的相互對(duì)
20、話(huà),參與異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭
目的:研究R.hoA/ROCK信號(hào)通路與JNK和ERK1/2信號(hào)通路的相互對(duì)話(huà)對(duì)ISO誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭的發(fā)病機(jī)制的影響,以及法舒地爾的抗心力衰竭作用。
方法:清潔級(jí)雄性SD大鼠48只,體重200~240g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,在室溫20℃~22℃,空氣濕度45%~55%的條件下飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成4組:空白對(duì)照組(CONT)、ISO模型組(ISO)、法舒地爾低劑
21、量組(FASL+ISO)、法舒地爾高劑量組(FASH+ISO),每組12只。FASL+ISO組和FASH+ISO組分別給予法舒地爾2mg·kg-1·d-1、10mg·kg-1·d-1,分兩次腹腔注射給藥,連續(xù)7d;ISO模型組、空白對(duì)照組給予等容積生理鹽水;除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠腹腔注射ISO,每天一次5mg/kg/d,連續(xù)7d,造成大鼠心力衰竭模型。各組大鼠注射ISO后全部存活,死亡率為0。停藥24h后,開(kāi)始檢測(cè)下列指標(biāo):(1)
22、心重量指數(shù):包括體重(body weight,BW);心臟重量(heart weight,HW);心臟重量/體重(HW/BW);左心室濕重(left ventricle wet weight,LV WW)/體重(LV WW/BW);左心室干重(left ventricle dry weight,LV DW)/體重(LV DW/BW);(2)組織學(xué)檢測(cè):包括HE染色觀(guān)察心肌的組織病理學(xué)變化和馬松染色觀(guān)察心肌纖維化變化;(3)血流動(dòng)力學(xué):包
23、括心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)等;(4)心電圖:標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)體表心電圖,用RM6240C多通道生理信號(hào)采集與處理系統(tǒng)采圖;(5)Western Blotting測(cè)定MYPT-1,p-MYPT-1,ERK1/2,p-ERK1/2,JNK,p-JNK和c-FLIPL蛋白的表達(dá);(6)RT-PCR測(cè)定ROCKI,c-fos
24、,c-jun,c-FLIPL mRNA的表達(dá)。
結(jié)果:
1 與CONT組比較,ISO模型組HW/13W升高141.53%(ISO:4.26±0.14vs.CONT:3.01±0.04,p<0.01);LVWW/BW升高127.60%(ISO:3.19±0.06vs.CONT:2.50±0.28,p<0.05);LVDW/BW升高138.18%(ISO:0.76±0.01vs.CONT:0.55±0.07,p<
25、0.05)。注射法舒地爾干預(yù),HW/BW顯著降低FASL+ISO組(FASL+ISO:3.77±0.10vs.ISO:4.26±0.14,p<0.05)和FASH+ISO組(FASH+ISO:3.44±0.08vs.ISO:4.26±0.14,p<0.01)。FASL+ISO組LVWW/BW顯著降低15.05%(FASL+ISO:2.71±0.16vs.ISO:3.19±0.06,p<0.05);FASH+ISO組顯著降低28.84%(
26、FASH+ISO:2.27±0.02vs.ISO:3.19±0.06,p<0.01)。LVDW/BW與LVWW/BW有相似的趨勢(shì),也顯著降低(FASL+ISO:0.63±0.06vs.ISO:0.76±0.01,p<0.05;FASH+ISO:0.60±0.01vs.ISO:0.76±0.01,p<0.01)。
2 法舒地爾對(duì)左心室形態(tài)學(xué)變化的影響
心肌組織HE染色和馬松染色后分別進(jìn)行左心室形態(tài)學(xué)和左心室纖維
27、化研究。ISO導(dǎo)致心肌勞損和纖維化(p<0.01),好發(fā)部位在心內(nèi)膜。用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)膠原纖維化面積。ISO模型組與CONT組比較,心肌纖維化升高約84.56%,法舒地爾可以減輕纖維化程度并呈劑量依賴(lài)性(FASL+ISO組43.79%,F(xiàn)ASH+ISO組20.01%)。
3 法舒地爾對(duì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響
與CONT比較,ISO模型組HR顯著升高(從343±9.6增至424±8.2bpm
28、,p<0.01);LVEDP也顯著升高(從4.77±0.38增至15.37±0.49mmHg,p<0.01)。此外,ISO模型組的LVSP顯著降低(從143±5.8降至98±8.2mmHg,p<0.05);±dp/dtmax也顯著降低(+dp/dtmax從8311±437降至4339±232mmHg/s,p<0.05;-dp/dtmax從7116±272降至3623±598mmHg/s,p<0.05)。LVSP和±dp/dtmax對(duì)前負(fù)
29、荷和后負(fù)荷都敏感,血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變表明ISO模型組左心室功能紊亂,造模成功。與ISO模型組相比,法舒地爾處理后,F(xiàn)ASL+ISO組可明顯改善心肌功能,收縮壓和舒張壓顯著升高,LVSP從98±8.2升高到126±6.7mmHg(p<0.05),±dp/dtmax顯著升高(+dp/dtmax從4339±232增至5787±246mmHg/s,p<0.01;-dp/dtmax從3623±598增至5130±1344mmHg/s,p<0.05
30、),LVEDP(從15.37±0.49降至11.73±1.31mmHg,p<0.05)。FASH+ISO組LVSP從98±8.2增至140±8.0mmHg(p<0.05),±dp/dt顯著升高(+dp/dtmax從4339±232增至7861±324mmHg/s,p<0.01;-dp/dtmax從3623±598增至6660±334mmHg/s,p<0.05),LVEDP(從15.37±0.49降至7.60±0.33mmHg,p<0.0
31、5)。
4 法舒地爾對(duì)體表心電圖(ECG)的影響
ISO可引起大鼠ECG標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)ST段下移,T波反向,典型的心率失常,法舒地爾治療一周后可以顯著改善心肌功能紊亂癥狀。
5 法舒地爾對(duì)ROCK活性的影響
從左心室提總RNA,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。與CONT比較,ISO模型組ROCK ImRNA活性顯著升高(p<0.01),法舒地爾處理后ROCK ImRNA活性顯著降低(p<0.01
32、)。我們還檢測(cè)了RhoA/ROCK信號(hào)通路下游的靶蛋白MYPT-1活性。ISO使MYPT-1磷酸化增加(p<0.01),但是法舒地爾可以抑制MYPT-1磷酸化增加,并呈劑量依賴(lài)性(p<0.05或 p<0.01)。
6 法舒地爾對(duì)細(xì)胞核內(nèi)ERK活性的影響
Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與CONT比較,ISO可明顯提高ERK轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核的能力(p<0.01),而法舒地爾減少ERK轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核的
33、量(p<0.01)。
7 法舒地爾對(duì)JNK活性的影響
Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與CONT相比,ISO使JNK磷酸化提高到189.24%(p<0.01),而法舒地爾減少JNK磷酸化約24.71%(p<0.01)和43.37%(p<0.01)。
8 法舒地爾對(duì)c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的影響
RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與CONT比較,ISO模型組c-fo
34、s和c-junmRNA表達(dá)顯著升高到252.92%(p<0.01)或247.45%(p<0.01)。高劑量法舒地爾減少c-fos和c-jun mRNA表達(dá)30.84%(p<0.01)和41.25%(p<0.01),而低劑量的法舒地爾效果明顯。
9 法舒地爾對(duì)c-FLIPL mRNA和蛋白表達(dá)的影響
與CONT比較,ISO模型組c-FLIPL mRNA表達(dá)降低,而法舒地爾使c-FLIPL mRNA表達(dá)有所恢復(fù)(
35、p<0.01)。c-FLIPL蛋白表達(dá)與c-FLIPLmRNA表達(dá)一致。
小結(jié):RhoA/ROCK信號(hào)通路與JNK和ERK1/2信號(hào)通路的相互對(duì)話(huà),介導(dǎo)了ISO誘導(dǎo)大鼠心力衰竭的發(fā)病機(jī)制。法舒地爾通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路,調(diào)控ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚,改善心肌纖維化,緩解超負(fù)荷心臟的心力衰竭。
第三部分 RhoA/ROCK信號(hào)通路干預(yù)大鼠甲亢性心肌病的發(fā)病機(jī)制。
目的:研究RhoA/ROC
36、K信號(hào)通路對(duì)大鼠甲亢性心肌病的影響以及法舒地爾的干預(yù)效應(yīng)。
方法:清潔級(jí)雄性SD大鼠48只,體重200-240g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,在室溫20℃~22℃,空氣濕度45%~55%的條件下飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成4組:空白對(duì)照組(CONT)、左旋甲狀腺素模型組(T4模型組)、法舒地爾低劑量組(FASL+T4)、法舒地爾高劑量組(FASH+T4),每組12只。FASL+T4組和FASH+T4組分別給予法舒地爾2mg·kg-1
37、·d-1和10mg·kg-1·d-1,分兩次腹腔注射給藥,連續(xù)14d;T4模型組、空白對(duì)照組給予等容積生理鹽水;除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠腹腔注射左旋甲狀腺素(L-thyroxine,T4)每天一次0.25mg/kg/d,連續(xù)14d,造成大鼠甲亢模型。大鼠注射T4后,全部存活,死亡率為0。停藥24h后,開(kāi)始檢測(cè)下列指標(biāo):(1)心重量指數(shù):包括BW、HW、HW/BW;(2)甲狀腺素檢測(cè):取血4ml,3500g離心收集血清,采用放射性免疫
38、鑒定法檢測(cè)血清中T4含量;(3)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定:包括HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax;(4)組織學(xué)檢測(cè);HE染色觀(guān)察心肌的組織病理學(xué)變化;(5)TUNEL染色測(cè)定心肌細(xì)胞的凋亡情況;(6)RT-PCR測(cè)定ROCKI,c-fos,c-jun,c-FLIPL mRNA的表達(dá);(7)Western Blotting測(cè)定bax,bcl-2和p-MYPT-1蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1 法舒地爾對(duì)心重量指數(shù)的
39、影響
與CONT組比較,T4模型組HW/BW顯著升高(4.33±0.13mg/gvs.3.12±0.15mg/g,n=6;p<0.01),體重卻顯著降低(191.2±3gvs.229.4±5g,n=6;p<0.01)。注射法舒地爾干預(yù),與T4模型組比較,F(xiàn)ASL+T4組和FASH+T4組HW/BW顯著降低(4.07±0.15mg/gvs.4.33±0.13mg/g,n=6;p<0.05;3.92±0.09mg/gvs.4.
40、33±0.13mg/g,n=6;p<0.01)。
2 法舒地爾對(duì)血清T4含量的影響
大鼠連續(xù)14天注射T4后,T4模型組血清中T4含量約為CONT的4倍(120±13nmol/1vs.38±3nmol/1,n=6;p<0.01),法舒地爾對(duì)大鼠血清中T4含量沒(méi)有明顯的影響,與T4模型組相比無(wú)顯著差異(FASL+T4組:118±14nmol/1vs.120±13nmol/1,n=6;p>0.05;FASH+T4
41、組:124±17nmol/1vs.120±13nmol/1,n=6;p>0.05)。
3 法舒地爾對(duì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響
與CONT比較,T4模型組±dp/dtmax降低約1/3(+dp/dtmax從6856±524降至4489±371;-dp/dtmax從6019±357降至3890±312mmHg/s);LVSP降低約28%(從142.2±22.4降至102.8±21.4mmHg);HR升高約14%(從3
42、57.5±10.4降至408.7±34.8bpm);LVEDP升高約3倍(從6.7±0.58降至17.6±1.15)。FASL+T4和FASH+T4兩組大鼠HR,LVEDP,LVSP,+dp/dtmax和-dp/dtmax與T4模型組相比明顯好轉(zhuǎn),與T4模型組相比有顯著性差異(FASL+T4組:HR降至338.4±43.8bp,LVEDP降至14.7±2.01mmHg,LVSP升至109.4±10.3mmHg,+dp/dtmax升至58
43、87±393mmHg/s,-dp/dtmax升至5104±380mmHg;FASH+T4組:HR降至330.2±32.2bpm,LVEDP降至12.1±1.68mmHg,LVSP升至127.2±19.7mmHg,+dp/dtmax升至6162±553mmHg/s,-dp/dtmax升至5545±437mmHg)。
4 法舒地爾對(duì)心臟形態(tài)學(xué)的影響
HE染色用來(lái)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。T4模型組細(xì)胞核腫大,心肌肥厚及間質(zhì)
44、纖維化,肌纖維重度紊亂。法舒地爾可以緩解T4導(dǎo)致的心肌肥厚,并呈劑量依賴(lài)性。
5 法舒地爾對(duì)左心室凋亡的影響
TUNEL染色檢測(cè)左心室的凋亡。T4模型組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著提高。法舒地爾可以引起凋亡細(xì)胞的減少,并呈劑量依賴(lài)性。
從左心室提總RNA,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。與CONT比較,T4模型組ROCK I mRNA活性顯著升高近2倍(p<0.01),法舒地爾處理后ROCKImRNA活
45、性顯著降低(p<0.01)。RhoA/ROCK信號(hào)通路下游的靶蛋白MYPT-1活性檢測(cè)結(jié)果表明,T4使MYPT-1磷酸化增加(p<0.01),而法舒地爾可以抑制MYPT-1磷酸化增加(p<0.01)。
7 法舒地爾對(duì)c-fos,c-jun和c-FLIPL mRNA表達(dá)的影響
RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與CONT比較,T4模型組c-fos和c-jun mRNA表達(dá)顯著升高(p<0.01),而c-FLIPL mR
46、NA表達(dá)顯著降低(p<0.01)。在FASL+T4和FASH+T4組,法舒地爾顯著減少c-fos和c-jun mRNA表達(dá)(p<0.01)。顯著升高c-FLIPL mRNA表達(dá)(p<0.01)。
8 法舒地爾對(duì)bax和bcl-2表達(dá)的影響
與CONT比較,T4模型組bax表達(dá)顯著升高是CONT組近5倍,而bcl-2顯著降低(p<0.01)。注射法舒地爾干預(yù),bax表達(dá)顯著降低(p<0.01),并呈劑量依賴(lài)性。
47、高劑量法舒地爾可以引起bcl-2表達(dá)顯著升高(p<0.01),但是低劑量法舒地爾雖可使bcl-2表達(dá)有所升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
小結(jié):大鼠甲亢性心肌病發(fā)病過(guò)程中心肌肥厚明顯,負(fù)荷增加,這些病理過(guò)程伴隨著RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活,進(jìn)而使AP1(c-fos和c-jun)活性增加,而使c-FLIPL表達(dá)下調(diào)。法舒地爾通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路的激活,緩解心肌肥厚程度,改善心肌功能,并呈劑量依賴(lài)性。
48、結(jié)論
1 RhoA/ROCK信號(hào)通路通過(guò)提高c-jun,c-fos,bax和NF-κB的活性而參與ADR誘導(dǎo)的心肌病的發(fā)病過(guò)程。法舒地爾干預(yù)可抑制RhoA/ROCK介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和左心室功能紊亂。
2 ISO導(dǎo)致的心衰與激活RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。法舒地爾抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路,從而抑制JNK活性,ERK轉(zhuǎn)運(yùn)入核,AP-1(c-fos和c-jun)的表達(dá)和引起c-FLIPL的上調(diào),改善IS
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