RhoA-ROCK信號通路在內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、血管新生參與很多生理與病理過程，其在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展(如冠狀動脈粥樣硬化病理性滋養(yǎng)血管的形成)和治療(如心肌梗死時缺血組織血管新生)中發(fā)揮重要作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem，RAS)是重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是該系統(tǒng)的重要生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ促進(jìn)血管生成。Rho蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命過程，家族分子RhoA與其下游效應(yīng)分子Rho激

2、酶(Rhoassociatedkinase，ROCK)是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分，在AngⅡ的作用下可有效激活。近來，研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK及其下游促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)通路參與調(diào)控血管生成。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一類能增殖和分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的前體細(xì)胞。大量研究表明，E

3、PCs不僅參與血管形成(angiogenesis)，同時也參與出生后血管發(fā)生(vasculogenesis)。目前，RhoA/ROCK-MAPK信號通路在AngⅡ介導(dǎo)的EPC血管新生中的作用未見報道。本研究著重探討RhoA/ROCK-MAPK信號通路在AngⅡ介導(dǎo)的EPCs成血管相關(guān)功能中的作用，為血管新生相關(guān)疾病治療提供重要靶點(diǎn)。
　　 第一部分RhoA/ROCK信號通路在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管相關(guān)功能中的作用研究<

4、br>　　 目的：
　　 本研究主要探索AngⅡ?qū)PCs增殖、遷移、黏附功能和體外血管形成能力的影響，同時進(jìn)一步研究該作用是否與RhoA/ROCK-MAPK信號通路有關(guān)。
　　 方法：
　　 (1)EPCs在無血清EBM-2培養(yǎng)基中孵育24小時后，加入不同濃度AngⅡ(0,0.1，1，10,100μM)共同作用48小時，檢測細(xì)胞增殖、遷移、黏附功能和體外血管形成能力。
　　 (2)在EPCs中加入Rh

5、oA/ROCK通路抑制劑包括牻牛兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GGTI-286，Rho的抑制劑C3exoenzyme或ROCK的抑制劑Y-27632先孵育30min，然后與AngⅡ(1μM)共同孵育48h，加藥前細(xì)胞在無血清EBM-2培養(yǎng)基中孵育24h，檢測細(xì)胞增殖、遷移、黏附功能和體外血管形成能力。
　　 (3)在EPCs中加入C3exoenzyme孵育48h，然后加入AngⅡ(1μM)共同孵育15min，用pulldown試劑盒和w

6、esternblot技術(shù)檢測活化RhoA的改變。
　　 (4)在EPCs中加入C3exoenzyme，GGTI-286和Y-27632孵育48h，然后加入AngⅡ(1μM)共同孵育15min，用westernblot技術(shù)檢測檢測ERK1/2，JNK和p38MAPK的活性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)AngⅡ促進(jìn)EPCs遷移、黏附功能和體外血管形成能力，在1μM和10μM時作用顯著，不影響EPCs增殖能力。

7、　　 (2)RhoA/ROCK通路抑制劑C3exoenzyme，GGTI-286和Y-27632可抑制AngⅡ?qū)PCs遷移、黏附功能和體外血管形成能力的促進(jìn)作用。
　　 (3)AngⅡ增加RhoA的活性，該作用能被Rho的抑制劑C3exoenzyme抑制。
　　 (4)AngⅡ促進(jìn)JNK和p38的激活，該作用能被C3exoenzyme，GGTI-286和Y-27632抑制。
　　 結(jié)論：
　　 本研究

8、結(jié)果表明，AngⅡ促進(jìn)EPCs遷移、黏附功能和體外血管形成能力，該作用主要是通過激活RhoA/ROCK及其下游MAPK通路來實(shí)現(xiàn)。
　　 第二部分法尼基焦磷酸合成酶抑制劑唑來膦酸鈉對內(nèi)皮祖細(xì)胞成血管相關(guān)功能的影響及機(jī)理研究
　　 目的：
　　 本研究探索法尼基焦磷酸合成酶抑制劑唑來膦酸鈉(Zoledronate，Zol)和AngⅡ?qū)PCs增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力的影響，同時進(jìn)一步研究該作用是否與Rho

9、A/ROCK-MAPK信號通路有關(guān)。
　　 方法：
　　 (1)在EPCs中加入不同濃度Zol(0,25，50,75，100μM)和GGOH(50μM)共同孵育30min后再加入AngⅡ(1μM)共同作用48小時，加藥前細(xì)胞在無血清EBM-2培養(yǎng)基中孵育24小時，檢測細(xì)胞增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力。
　　 (2)在EPCs中加入Zol(50μM)和GGOH(50μM)孵育48h，然后加入AngⅡ(1μM)

10、共同孵育15min，用pulldown試劑盒和westernblot技術(shù)檢測活化RhoA的改變及Erk1/2，JNK和p38MAPK的活性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Zol呈劑量依賴性抑制AngⅡ?qū)PCs增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力的促進(jìn)作用，GGOH能夠部分逆轉(zhuǎn)Zol對EPCs功能的影響。
　　 (2)Zol降低AngⅡ?qū)hoA的活化和Erk1/2、JNK的激活，該作用能被GGOH部分逆轉(zhuǎn)。