兩個(gè)棉花GhPRP基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、棉纖維是從胚珠表皮細(xì)胞分化而來的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其發(fā)育過程可分為纖維起始、纖維細(xì)胞的伸長、次生細(xì)胞壁的加厚和脫水成熟4個(gè)時(shí)期，從分子水平上揭示棉纖維細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。在前面的研究中，我們分離了兩個(gè)編碼富含脯氨酸的蛋白質(zhì)基因GhPRP3和GhPRP5，Northern blotting和Real-time RT-PCR結(jié)果顯示這兩個(gè)GhPRPs基因在纖維中特異表達(dá)，并受棉花纖維發(fā)育階段調(diào)控，本文對(duì)這兩個(gè)基因在棉

2、花纖維發(fā)育過程中的表達(dá)調(diào)控、啟動(dòng)子活性、蛋白質(zhì)細(xì)胞亞定位及功能進(jìn)行了研究，取得主要研究結(jié)果如下： 1.應(yīng)用離體胚珠培養(yǎng)技術(shù)，研究GhPRP3和GhPRP5基因在多種植物激素、鹽、干旱等脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示GhPRP3在GA3和干旱處理后，表達(dá)上調(diào)；GhPRP5在經(jīng)KT，ABA及干旱處理后，表達(dá)上調(diào)。說明這兩個(gè)基因的表達(dá)受到植物激素和外界脅迫的調(diào)節(jié)。 2.利用Genome Walking的方法分離了這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子

3、，構(gòu)建了GhPRP5 promoter：：GUS融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株GUS染色研究啟動(dòng)子活性。組織化學(xué)分析表明，在GhPRP5啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的表皮毛中表達(dá)，由于表皮毛與纖維在結(jié)構(gòu)和遺傳上的相似性，間接證實(shí)了該啟動(dòng)子是纖維特異性的。 3.利用eGFP報(bào)告基因，構(gòu)建目的基因與eGFP的融合表達(dá)載體，研究了GhPRP3和GhPRP5的亞細(xì)胞定位。將GhPRP3：：GF

4、P和GhPRP5：：GFP導(dǎo)入棉花，獲得轉(zhuǎn)化愈傷組織。利用激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察該融合蛋白的細(xì)胞亞定位情況，結(jié)果表明，綠色熒光集中在壁膜上，質(zhì)壁分離后發(fā)現(xiàn)熒光在質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)里都有分布，顯示這兩個(gè)蛋白均定位在質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)中。 4.利用DNA重組技術(shù)，將GhPRP3和GhPRP5基因分別克隆到pBI121質(zhì)粒中，構(gòu)建了過量表達(dá)載體，對(duì)擬南芥進(jìn)行浸花法轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，相關(guān)性狀分析仍在分析中。同時(shí)，為研究這兩個(gè)富含脯氨酸蛋