榨菜的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子分析.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文榨菜的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子分析姓名：張維申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：郭得平陳集雙20060501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要本研究以榨菜(Brassicajunceavattsatsai)為試驗(yàn)材料，首先構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因植物雙價(jià)表達(dá)載體pCamTuMVCP—CMVCP，然后以子葉為外植體建立了根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的蕪菁花葉病毒cP基因和黃瓜花葉病毒cP基因的轉(zhuǎn)化

2、體系，得到了榨菜轉(zhuǎn)基因植株。本研究不僅為利用現(xiàn)代病毒分子生物學(xué)和植物基因工程育種獲得抗病毒農(nóng)作物提供理論和技術(shù)依據(jù)，也為榨菜以及其他十字花科作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供技術(shù)平臺(tái)。主要結(jié)果如下：1構(gòu)建植物雙價(jià)表達(dá)載體pCamTuMVCPCMVCP根據(jù)已報(bào)道的TuMVCP和CMVCP核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，分別從pMD—TuMVCP和pUC—CMVCP擴(kuò)增TuMvCP和CMVCP基因并回收，并與pUCmTi相連，分別酶切pUCmTi，將TuMVCP

3、克隆到pCambial301，得到pCam—TuMVCP質(zhì)粒，將CMVCP克隆到pBll21，得到pBICMVCP質(zhì)粒。用EcoRMPstI酶切pBI—CMVCP質(zhì)粒，將含有CMVCP的片段連接到pCamTuMVCP上得到植物雙價(jià)表達(dá)載體pCam—TuMVCPCMVCP。用凍融法將植物表達(dá)載體pCamTuMVCPCMVCP轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHAl05菌株中，經(jīng)鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子用于榨菜轉(zhuǎn)化。2以子葉為外植體的基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立研究了不同

4、選擇壓和不同濃度抗生素條件對(duì)子葉分化的影響，以及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(1d，2d，3d，4d)、共培養(yǎng)時(shí)間(1d，2d，3d，4d)對(duì)子葉轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，潮霉素125m鯽能較好的篩選抗性芽，羧芐青霉素500m【鮒能較好的抑制農(nóng)桿菌的過度繁殖，預(yù)培養(yǎng)2d的外植體根癌農(nóng)桿菌侵染15min在28。C共培養(yǎng)2d的條件下獲得了最高的分化頻率。3轉(zhuǎn)化植株的分子鑒定經(jīng)PCR及RTPCR檢測(cè)，兩個(gè)目的基因已經(jīng)整合到榨菜染色體基因組中，從而證明外源基因整