甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙烯亞胺納米復(fù)合物介導(dǎo)的CXCL10基因治療聯(lián)合放療抗子宮頸癌作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:近年來(lái)，子宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，而放療在其治療中占據(jù)了舉足輕重的地位，但腫瘤的乏氧狀態(tài)等導(dǎo)致子宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抵抗，放療療效亟待改善。數(shù)十年來(lái)，基因治療掀起熱潮，而研究證實(shí)CXC趨化因子配體10(CXCL10)具有誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成、抗HPV病毒等多種抗子宮頸癌作用，甚至可起到放療增敏的作用。非病毒載體如納米材料作為理想的基因載體，可以有效地將治療基因被動(dòng)靶向于腫瘤細(xì)胞。因此設(shè)想采用一種納米材料載體負(fù)載CXCL10與放

2、療聯(lián)合，分別在體內(nèi)和體外探究其提高放療療效的作用，從而為形成結(jié)合放療和基因治療的子宮頸癌綜合治療新方法指明方向。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用低分子量PEI(1200Da)與mPEG-PCL(5000-2000Da)組裝成高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI。并采用Varian400型核磁共振儀和傅里葉紅外光譜儀對(duì)聚合物前體mPEG-PCL及該高分子聚合物mPEG-PCL-g-PEI的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過(guò)激光粒度儀和透射電子顯微鏡分別測(cè)

3、定mPEG-PCL-g-PEI及CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米粒子的粒徑、電位與形貌。利用帶正電荷的納米粒和帶負(fù)電荷的質(zhì)粒之間的靜電引力，制備了綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)探尋出納米粒負(fù)載質(zhì)粒DNA的最佳轉(zhuǎn)染比例，再在倒置熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒后表達(dá)綠色熒光蛋白的情況，接下來(lái)，用該納米粒負(fù)載CXCL10質(zhì)粒，采用PCR法擴(kuò)增CXCL10目的基因片段，電泳驗(yàn)證

4、轉(zhuǎn)染的成功。利用MTT法測(cè)定CXCL10/mPEG-PCL-g-PEI納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放療后的相對(duì)細(xì)胞活性。
　　結(jié)果:傅里葉變換紅外光譜、1H-核磁共振光譜對(duì)mPEG-PCL前體聚合物及聚合物mPEG-PCL-g-PEI的結(jié)構(gòu)表征證明該兩親性嵌段聚合物成功合成，具有良好的水溶性，且能夠在水溶液中自組裝成為納米膠束結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠電泳表明納米粒負(fù)載質(zhì)粒DNA的最佳轉(zhuǎn)染比例為:48/1(w/w)。mPEG-PCL-g-PEI及C

5、XCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米粒子(w/w:48/1)的透射電鏡圖表明兩種納米復(fù)合物均為球形。平均粒徑分別是20nm和46nm，電位分別為+21.76、+5.71mV。細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，在低濃度范圍內(nèi)，該納米材料細(xì)胞毒性較小，具有生物相容性，隨著聚合物濃度的增加，細(xì)胞毒性越大(p＜0.05)。最佳轉(zhuǎn)染質(zhì)量比(w/w:48/1)下載綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA-mPEG-PCL-g-PEI對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡成像證實(shí)

6、其轉(zhuǎn)染效率稍低于高分子量PEI25kD，但細(xì)胞毒性較小。PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段CXCL10基因片段所在的強(qiáng)電泳條帶證實(shí)載CXCL10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。MTT法初步證實(shí)CXCL10-mPEG-PCL-g-PEI納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后成功表達(dá)，并在3Gy、6Gy、9Gy的相對(duì)細(xì)胞活性小于單純材料組和載空質(zhì)粒材料組。
　　結(jié)論:mPEG-PCL-g-PEI被成功合成，在低濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞毒性較小，高濃度范圍細(xì)胞毒性與濃度呈正相關(guān)，且能自組