PCL-PEI納米粒子介導(dǎo)的CXCL10基因治療對(duì)放療殺傷宮頸癌細(xì)胞作用影響的體外研究.pdf

1、目的:宮頸癌(Cervical cancer)是一種起源于宮頸的惡性腫瘤。它是一種常見的惡性腫瘤，是世界上主要的惡性腫瘤之一。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于初步探討PCL-PEI(Polycaprolactone-Polyethylenimine，聚己內(nèi)酯-聚乙烯亞胺，PEA)介導(dǎo)的趨化因子CXCL10(Chemokine CXCL10)基因治療對(duì)放療殺傷宮頸癌細(xì)胞作用的影響。
　　方法:利用PEI(1.8kDa)和PCL通過邁克爾加成反應(yīng)

2、成功地合成了聚合物PCL-PEI，并用1H-核磁共振對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。使用激光粒度分析儀檢測(cè)PCL-PEI納米粒子的Zeta電位及粒徑。使用透射電鏡觀察PCL-PEI納米粒子以及PCL-PEI與CXCL10質(zhì)粒縮合后的納米復(fù)合物的形貌。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCL-PEI納米粒子的細(xì)胞毒性。在證實(shí)成功地合成了聚合物后，使用PCL-PEI納米粒子與綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP)制備了PCL-PEI+pEGFP納米復(fù)合物，通過瓊脂糖凝膠

3、電泳實(shí)驗(yàn)得到納米粒子與質(zhì)?？s合的最優(yōu)質(zhì)量比。接下來，按照最優(yōu)質(zhì)量比制備PCL-PEI+pEGFP納米復(fù)合物，通過倒置熒光顯微鏡觀察該復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后綠色熒光蛋白質(zhì)表達(dá)情況。隨后使用PCL-PEI+pCXCL10納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增CXCL10目標(biāo)基因片段，瓊脂電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。最后，實(shí)驗(yàn)將Hela細(xì)胞分成四組進(jìn)行處理，分別為空白對(duì)照+放療組，PCL-PEI+放療組，PCL-PEI+pPUC4.1（空

4、質(zhì)粒）+放療組，PCL-PEI+pCXCL10+放療組，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后行6Gy放療，放療48h后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，放療4小時(shí)內(nèi)行克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組的克隆形成能力。結(jié)果:成功地合成了可降解聚合物PCL-PEI，其能在PBS溶液中形成納米粒子，1H-核磁共振對(duì)聚合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，利用透射電鏡對(duì)聚合物進(jìn)行了形貌分析，證實(shí)其結(jié)構(gòu)與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致。激光粒度分析儀測(cè)得PCL-PEI的Zeta電位及粒徑分別為:+15mV，

5、213nm。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)測(cè)得PCL-PEI納米粒子縮合質(zhì)粒DNA的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1。MTT實(shí)驗(yàn)表明，聚合物的毒性較小，在工作濃度時(shí)幾乎沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。倒置熒光顯微鏡觀察到經(jīng)PCL-PEI+pEGFP納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞成功地表達(dá)了綠色熒光蛋白。PCR-瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PCL-PEI+pCXCL10納米復(fù)合物成功地轉(zhuǎn)染了Hela細(xì)胞。最后，流式細(xì)胞學(xué)證實(shí)PCL-PEI+pCXCL10+放療組的凋亡率明顯提高，克隆

6、形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)該組的克隆形成能力更弱。結(jié)論:1.成功地合成了聚合物PCL-PEI，其細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞毒性與濃度呈正相關(guān)，而在工作濃度時(shí)幾乎沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，是一種安全低毒的基因載體。2.PCL-PEI聚合物能在PBS中形成納米粒子，納米粒子表面帶正電荷，粒徑分布均勻。3.PCL-PEI納米粒子能縮合質(zhì)粒DNA，并能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中表達(dá)。4.初步證實(shí)成功表達(dá)了CXCL10的Hela細(xì)胞凋亡率更高，克隆形成能力更弱，表明PCL-PEI納