PCL-PEI納米粒子介導的CXCL10基因治療對放療殺傷宮頸癌細胞作用影響的體外研究.pdf

1、目的:宮頸癌(Cervical cancer)是一種起源于宮頸的惡性腫瘤。它是一種常見的惡性腫瘤，是世界上主要的惡性腫瘤之一。本實驗的研究目的在于初步探討PCL-PEI(Polycaprolactone-Polyethylenimine，聚己內(nèi)酯-聚乙烯亞胺，PEA)介導的趨化因子CXCL10(Chemokine CXCL10)基因治療對放療殺傷宮頸癌細胞作用的影響。
　　方法:利用PEI(1.8kDa)和PCL通過邁克爾加成反應

2、成功地合成了聚合物PCL-PEI，并用1H-核磁共振對聚合物的結構進行了分析。使用激光粒度分析儀檢測PCL-PEI納米粒子的Zeta電位及粒徑。使用透射電鏡觀察PCL-PEI納米粒子以及PCL-PEI與CXCL10質(zhì)粒縮合后的納米復合物的形貌。通過MTT實驗檢測PCL-PEI納米粒子的細胞毒性。在證實成功地合成了聚合物后，使用PCL-PEI納米粒子與綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP)制備了PCL-PEI+pEGFP納米復合物，通過瓊脂糖凝膠

3、電泳實驗得到納米粒子與質(zhì)?？s合的最優(yōu)質(zhì)量比。接下來，按照最優(yōu)質(zhì)量比制備PCL-PEI+pEGFP納米復合物，通過倒置熒光顯微鏡觀察該復合物轉(zhuǎn)染Hela細胞后綠色熒光蛋白質(zhì)表達情況。隨后使用PCL-PEI+pCXCL10納米復合物轉(zhuǎn)染Hela細胞，通過PCR實驗擴增CXCL10目標基因片段，瓊脂電泳實驗證實轉(zhuǎn)染成功。最后，實驗將Hela細胞分成四組進行處理，分別為空白對照+放療組，PCL-PEI+放療組，PCL-PEI+pPUC4.1（空

4、質(zhì)粒）+放療組，PCL-PEI+pCXCL10+放療組，待細胞轉(zhuǎn)染24小時后行6Gy放療，放療48h后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，放療4小時內(nèi)行克隆形成實驗測定各組的克隆形成能力。結果:成功地合成了可降解聚合物PCL-PEI，其能在PBS溶液中形成納米粒子，1H-核磁共振對聚合物的結構進行了分析，利用透射電鏡對聚合物進行了形貌分析，證實其結構與目標產(chǎn)物結構一致。激光粒度分析儀測得PCL-PEI的Zeta電位及粒徑分別為:+15mV，

5、213nm。瓊脂糖凝膠電泳實驗測得PCL-PEI納米粒子縮合質(zhì)粒DNA的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1。MTT實驗表明，聚合物的毒性較小，在工作濃度時幾乎沒有表現(xiàn)出細胞毒性。倒置熒光顯微鏡觀察到經(jīng)PCL-PEI+pEGFP納米復合物轉(zhuǎn)染的Hela細胞成功地表達了綠色熒光蛋白。PCR-瓊脂凝膠電泳實驗證實了PCL-PEI+pCXCL10納米復合物成功地轉(zhuǎn)染了Hela細胞。最后，流式細胞學證實PCL-PEI+pCXCL10+放療組的凋亡率明顯提高，克隆

6、形成實驗證實該組的克隆形成能力更弱。結論:1.成功地合成了聚合物PCL-PEI，其細胞毒性較低，細胞毒性與濃度呈正相關，而在工作濃度時幾乎沒有表現(xiàn)出細胞毒性，是一種安全低毒的基因載體。2.PCL-PEI聚合物能在PBS中形成納米粒子，納米粒子表面帶正電荷，粒徑分布均勻。3.PCL-PEI納米粒子能縮合質(zhì)粒DNA，并能轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中表達。4.初步證實成功表達了CXCL10的Hela細胞凋亡率更高，克隆形成能力更弱，表明PCL-PEI納