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文檔簡介
1、目的: 建立動物模型,采用免疫組化、RT-PCR、Western免疫印跡分析方法,檢測雷帕霉素靶蛋白(mTOR)下游底物核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在正畸牙移動牙周組織改建過程中的表達及變化,研究正畸力作用下兔牙周組織中核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在牙周組織改建過程中的作用。 方法: 1、建立動物模型選用36只日本大耳白兔(體重2.0±0.2kg),建立正畸牙移動的動物模型,按照3天、5天、7天、
2、14天隨機分組,每組9只。上頜右側戴矯治器為實驗組,分別在切牙與磨牙的近頸端纏繞雙股結扎絲,然后在切牙與磨牙間放置鎳鈦螺簧,力值80g,使磨牙近中移動。上頜左側未戴矯治器為對照組。實驗動物分別于3、5、7、14天處死。 2、免疫組化SP法將實驗組及對照組牙周組織石蠟標本進行核糖體蛋白S6激酶(p70 S6 Kinase,p70 S6K)免疫組化染色,觀察其表達并分析其意義。 3、RT-PCR按逆轉錄試劑盒使用說明操作,選
3、用oligo dT作引物合成第一鏈cDNA,RT-PCR檢測正畸力作用下p70 S6K在牙周組織中的表達變化,瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色分析檢測結果。 4、Western免疫印跡分析吸取上清,棄沉淀,考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白濃度。上清用10% SDS-PAGE分離然后轉移到PVDF膜上,經(jīng)2h 50V的轉印后TTBS洗膜5 min×3次。用含5%BSA的TTBS封閉,4℃過夜,再與抗p70 S6K抗體室溫孵育2h,與相
4、應的HRP標記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫孵育1h,ECL系統(tǒng)顯影。 5、統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對戴矯治器組與未戴矯治器組進行配對t檢驗。P<0.05為顯著性差異。 結果: 1、組織形態(tài)學觀察組織形態(tài)學觀察:實驗組的牙周組織較對照組有明顯改建,牙槽骨由致密變得疏松,細胞的排列由有序變紊亂,牙槽骨的骨壁由平整變得凸凹不平,出現(xiàn)了破骨細胞及骨陷窩。 2、p70 S6K在牙周組織中的定位免疫組化結
5、果:正畸力作用下p70 S6K在牙周組織細胞中染色增強,且主要定位于成纖維細胞、成骨細胞胞漿中,血管內皮細胞及骨細胞胞漿中亦可見。 3、RT-PCR與對照組比較,加力3天后牙周組織中p70 S6K mRNA表達增加,7天明顯增加,隨后下降,3天、7天、14天各時段與對照組比較均有統(tǒng)計學差異,其中7天差異更顯著。 4、Western免疫印跡分析與RT-PCR結果相一致。正畸力作用下p70 S6K在兔牙周組織中的蛋白表達增加
6、,7天尤為顯著,隨后下降。3天、7天、14天各時段與對照組比較均有統(tǒng)計學差異,其中7天差異更顯著。 結論: 1、p70 S6K在正畸力作用下兔牙周組織細胞中染色增強,且主要定位于成骨細胞,成纖維細胞胞漿中,血管內皮細胞和骨細胞胞漿中亦可見。 2、正畸力作用下兔牙周組織中p70 S6K的表達增加。 3、隨著牙周組織的改建,p70 S6K的表達量7天時達高峰。 4、p70 S6K參與正畸牙移動過程中牙
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