正畸力作用下兔牙周組織中核糖體蛋白S6激酶的表達(dá).pdf

1、目的: 建立動物模型，采用免疫組化、RT-PCR、Western免疫印跡分析方法，檢測雷帕霉素靶蛋白(mTOR)下游底物核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在正畸牙移動牙周組織改建過程中的表達(dá)及變化，研究正畸力作用下兔牙周組織中核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在牙周組織改建過程中的作用。 方法: 1、建立動物模型選用36只日本大耳白兔(體重2.0±0.2kg)，建立正畸牙移動的動物模型，按照3天、5天、7天、

2、14天隨機(jī)分組，每組9只。上頜右側(cè)戴矯治器為實(shí)驗(yàn)組，分別在切牙與磨牙的近頸端纏繞雙股結(jié)扎絲，然后在切牙與磨牙間放置鎳鈦螺簧，力值80g，使磨牙近中移動。上頜左側(cè)未戴矯治器為對照組。實(shí)驗(yàn)動物分別于3、5、7、14天處死。 2、免疫組化SP法將實(shí)驗(yàn)組及對照組牙周組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行核糖體蛋白S6激酶(p70 S6 Kinase，p70 S6K)免疫組化染色，觀察其表達(dá)并分析其意義。 3、RT-PCR按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作，選

3、用oligo dT作引物合成第一鏈cDNA，RT-PCR檢測正畸力作用下p70 S6K在牙周組織中的表達(dá)變化，瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色分析檢測結(jié)果。 4、Western免疫印跡分析吸取上清，棄沉淀，考馬斯亮藍(lán)法測定樣品中蛋白濃度。上清用10％ SDS-PAGE分離然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)2h 50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜5 min×3次。用含5％BSA的TTBS封閉，4℃過夜，再與抗p70 S6K抗體室溫孵育2h，與相

4、應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫孵育1h，ECL系統(tǒng)顯影。 5、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對戴矯治器組與未戴矯治器組進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性差異。 結(jié)果: 1、組織形態(tài)學(xué)觀察組織形態(tài)學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)組的牙周組織較對照組有明顯改建，牙槽骨由致密變得疏松，細(xì)胞的排列由有序變紊亂，牙槽骨的骨壁由平整變得凸凹不平，出現(xiàn)了破骨細(xì)胞及骨陷窩。 2、p70 S6K在牙周組織中的定位免疫組化結(jié)

5、果：正畸力作用下p70 S6K在牙周組織細(xì)胞中染色增強(qiáng)，且主要定位于成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞漿中，血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨細(xì)胞胞漿中亦可見。 3、RT-PCR與對照組比較，加力3天后牙周組織中p70 S6K mRNA表達(dá)增加，7天明顯增加，隨后下降，3天、7天、14天各時段與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，其中7天差異更顯著。 4、Western免疫印跡分析與RT-PCR結(jié)果相一致。正畸力作用下p70 S6K在兔牙周組織中的蛋白表達(dá)增加

6、，7天尤為顯著，隨后下降。3天、7天、14天各時段與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，其中7天差異更顯著。 結(jié)論: 1、p70 S6K在正畸力作用下兔牙周組織細(xì)胞中染色增強(qiáng)，且主要定位于成骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞胞漿中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨細(xì)胞胞漿中亦可見。 2、正畸力作用下兔牙周組織中p70 S6K的表達(dá)增加。 3、隨著牙周組織的改建，p70 S6K的表達(dá)量7天時達(dá)高峰。 4、p70 S6K參與正畸牙移動過程中牙