過度活躍膀胱中不穩(wěn)定收縮機制的實驗研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：過度活躍膀胱中不穩(wěn)定收縮的神經肌電研究 背景和目的： OAB患者尿急的感覺首先考慮有來自膀胱經盆神經向中樞的傳入信號；再次不穩(wěn)定收縮時，膀胱壓力的期相性升高可能和支配膀胱的副交感神經(亦走行在盆神經內)的傳出信號有關。即便有證據說明這種不穩(wěn)定收縮的起源系由膀胱局部因素引發(fā)產生，甚至并不依賴于盆神經傳遞信號，但在其不穩(wěn)定收縮時膀胱的感覺傳入神經也可能會將壓力上升的感覺信號傳入中樞，而這

2、恰恰可能和OAB患者的尿急癥狀密切相關。 另一方面，從膀胱感覺角度(傳入神經纖維)考察，如果在不穩(wěn)定收縮時記錄到膀胱感覺神經的傳入信號隨膀胱壓力增強，則可說明不穩(wěn)定收縮時有傳入信號進入中樞，并且這可能是病人引發(fā)尿急癥狀的原因，從而說明膀胱不穩(wěn)定收縮是有其存在的神經因素，并且此傳入信號和臨床尿急癥狀密切。 材料和方法： 1.建立BOO大鼠，梗阻方法包括經恥骨上膀胱頸梗阻、經會陰尿道梗阻、和經閉孔恥骨后中段尿道梗阻。

3、 2.充盈性膀胱測壓檢查確定BOO大鼠6-8周后是否存在充盈期不穩(wěn)定收縮，按ICS的傳統(tǒng)標準大于15cmH2O的不穩(wěn)定收縮確定OAB大鼠。 3.烏拉坦麻醉OAB大鼠，分別在膀胱充盈測壓(模式A)和膀胱頸結扎等容(0.8ml;模式B)下，進行顯微手術暴露盆神經、陰部神經運動支、尿道外括約肌等盆會陰結構，進行同步化神經、肌電生理記錄，測定不穩(wěn)定收縮時盆神經傳入(夾傷盆神經記錄點的周圍端)電位信號或傳出(夾傷記錄點的中樞端)電

4、位信號，并同步測定陰部神經運動支電位、尿道外括約肌肌電及腹肌肌電的反射反應。對各神經電位和肌電圖進行不穩(wěn)定收縮前和不穩(wěn)定收縮時的放電頻率和幅度量化統(tǒng)計和比較。 4.分別對T8胸段脊髓中樞及控制膀胱的周圍神經進行截斷損傷，觀察OAB大鼠在膀胱充盈測壓(模式A)和等容(模式B)兩種情況下不穩(wěn)定收縮的前后改變，具體截斷包括T8段脊髓截斷、雙側盆神經截斷、腹交感干截斷、和雙側陰部神經截斷。統(tǒng)計并比較膀胱基礎壓、不穩(wěn)定收縮壓在截斷前后的變

5、化和差異。 5.進行OAB大鼠逼尿肌離體肌條實驗，在OAB離體逼尿肌條紀錄實驗中，為使得離體逼尿肌從去中樞控制狀態(tài)到完全去神經影響的狀態(tài)，引入一種含有多種神經受體阻滯劑的Cocktail混合液。摘取OAB大鼠膀胱，分離獲得離體平滑細肌條，進行一定初張力下的等長收縮實驗和電刺激試驗，紀錄在含有Cocktail混合液干預前后的37℃生理液孵浴下，OAB離體逼尿肌的電刺激收縮反應和肌條自發(fā)興奮收縮變化特征，分別比較這兩種收縮的幅度和頻

6、率在Cocktail干預前后差異。 結果： 1.三種不同的方法形成的BOO狀態(tài)在經充盈測壓后確定的OAB大鼠在膀胱重量及尿動力學相關指標比較之間均無明顯差異，但和正常大鼠均有顯著差異。 2.膀胱充盈測壓下(模式A)的同步神經肌電生理記錄，依據不穩(wěn)定收縮前和不穩(wěn)定收縮時盆神經傳入、傳出及相關神經肌電反應電位頻率或幅度是否存在顯著變化，不穩(wěn)定收縮可觀察到兩種類型，分別為收縮較大的B-Poab和較小的S-Poab。前者

7、同步盆神經傳入、傳出的信號統(tǒng)計增加顯著，并且能引發(fā)陰部神經、尿道外括約肌電圖和腹肌肌電圖反應的顯著變化。而S-Poab則均沒有上述盆神經傳入、傳出及相關神經神經肌電反應變化。 3.膀胱等容測壓情況下(模式B)的同步神經肌電生理記錄，發(fā)現(xiàn)膀胱基礎壓力升高，但同樣出現(xiàn)和前面充盈測壓模式A相似的充盈.排尿周期相似的排尿樣收縮周期，在排尿樣收縮的間期，也出現(xiàn)不穩(wěn)定收縮。并且同樣依據上述同步化神經肌電生理記錄反應的不同，不穩(wěn)定收縮分為有盆

8、神經傳入、傳出信號變化和相關神經肌電生理反射的B-Poab和均沒有神經肌電變化和反射的S-Poab。 4.脊髓中樞截斷后對OAB大鼠不穩(wěn)定收縮影響的結果： T8脊髓截斷后，在充盈測壓情況下(模式A)，膀胱失去充盈.排尿收縮周期，膀胱基礎壓顯著升高，其中B-Poab不穩(wěn)定收縮消失，S-Poab仍然存在，并且幅度比截斷前稍有上升，但無顯著差異。 在膀胱等容測壓下(模式B)，T8脊髓截斷后膀胱失去排尿樣收縮周期，膀胱基

9、礎壓顯著升高，B-Poab消失，S-Poab幅度稍有上升，但和損傷前無顯著差異。 5.膀胱周圍神經逐步截斷后對OAB大鼠不穩(wěn)定收縮影響的結果：膀胱的外周神經逐步截斷依盆神經、交感神經、和陰部神經的次序，在充盈測壓下(模式A)，膀胱失去充盈-排尿收縮周期，膀胱基礎壓顯著升高，不穩(wěn)定收縮中B-Poab消失，S-Poab保留且前后無顯著差異。在陰部神經損傷時還觀察到膀胱基礎壓顯著下降。 在膀胱等容測壓下(模式B)，膀胱失去排尿

10、樣收縮周期，基礎膀胱壓同樣顯著升高，B-Poab不穩(wěn)定收縮消失，S-Poab不穩(wěn)定收縮仍然存在并改變不明顯。 6.0AB大鼠逼尿肌離體肌條實驗結果，在離體肌條刺激收縮實驗中，Cocktail能有效消除電刺激使膀胱產生的收縮，說明Cocktail能消除逼尿肌局部神經因素的影響。在OAB膀胱離體肌條自發(fā)興奮收縮實驗中，在加入Cocktail前后OAB肌條的自發(fā)興奮收縮并沒有被消除和降低，并且幅度有顯著上升。 結論：

11、1.0AB膀胱不穩(wěn)定收縮可能存在兩種機制，即B-Poab和S-Poab。前者有盆神經傳入、傳出信號參與，這可能是尿急癥狀產生的神經信號基礎，并且此種不穩(wěn)定收縮能引發(fā)其它相關的神經肌電生理反射。而S-Poab沒有中樞信號參與其收縮，也沒有產生膀胱感覺并傳入中樞和引發(fā)其它相關神經肌電生理反射。 2.脊髓及膀胱周圍神經損傷后B-Poab消失，而S-Poab不會因此截斷而減弱。這更加確立了OAB膀胱部分不穩(wěn)定收縮有神經因素參與，這成為解

12、釋尿急及相關繼發(fā)癥狀的基礎，但同時也證明了OAB膀胱有獨立于神經控制影響的不穩(wěn)定收縮，并且這種不穩(wěn)定收縮的產生并不依賴于中樞和周圍神經。 3.離體的OAB逼尿肌在進一步消除膀胱局部神經因素的情況下，證實其過度的自發(fā)興奮收縮沒有減弱，說明OAB肌條的自發(fā)收縮有來自逼尿肌本身的興奮，這可能是在體狀態(tài)時不穩(wěn)定收縮起源和存在的逼尿肌自身因素基礎。 第二部分：過度活躍膀胱中雷諾定受體的初步研究 背景和目的： 在本部

13、分的研究中擬考察OAB膀胱逼尿肌內RyR通道的mRNA、蛋白表達是否存在改變，和RyR通道在OAB逼尿肌中對膜興奮性及自發(fā)收縮調控功能等影響是否有顯著變化，擬初步探討它的改變與OAB中自發(fā)興奮收縮過度可能聯(lián)系。 材料和方法： 1.通過RT-PCR實驗測定OAB大鼠模型逼尿肌組織的RyR通道亞型表達，通過β-action內參照半定量RT-PCR實驗，分析確認RyR通道m(xù)RNA表達在OAB膀胱逼尿肌與正常膀胱逼尿肌之間是否存

14、在差異。通過RyR通道蛋白westernblot分析確認RyR通道蛋白表達在OAB膀胱逼尿肌與正常膀胱逼尿肌之間是否存在差異。 2.正常離體膀胱肌條在Cocktail-PSS生理液中消除了局部神經因素影響后，分別應用VDCC鈣通道阻滯劑(nimodipine)、RyR通道激動劑(caffeine)、和RyR通道阻滯劑(ryanodine)的情況下，觀察和比較干預前后其自發(fā)興奮收縮幅度和頻率改變情況。同樣對于OAB膀胱離體肌條進行

15、觀察，分析前后自發(fā)興奮收縮頻率和幅度變化，并且和正常進行比較，分析受藥物干預后對自發(fā)興奮收縮調控的差異。 結果： 1.RT-PCR提示OAB膀胱逼尿肌中RyR只表達RyR2亞型，和正常對照無亞型差異。半定量RT-PCR實驗和westernblot分析實驗顯示RyR通道m(xù)RNA和蛋白表達在OAB膀胱平滑肌中與正常逼尿肌相比都有顯著降低。 2.在Cocktail-PSS生理液孵浴中，對已有穩(wěn)定自發(fā)性收縮的離體逼尿肌條

16、紀錄中，當加入RyR通道阻滯劑ryanodine后，正常組離體肌條自發(fā)收縮的頻率顯著升高，且升高后的頻率特征和OAB膀胱離體肌條組頻率比較無顯著差異；而OAB組在ryanodine給予后自發(fā)收縮改變不顯著。在caffeine應用后顯示能顯著抑制自發(fā)收縮活性，無論是OAB膀胱離體肌條還是正常離體肌條紀錄中都是如此。在L-型Ca2+通道阻滯劑nimodipine給予后，能消除正常膀胱離體肌條自發(fā)收縮，對OAB膀胱離體肌條的自發(fā)收縮也幾乎被消

17、除，但仍還殘留有微小收縮節(jié)律。 結論： RyR通道在正常逼尿肌的自發(fā)收縮中起到負性調節(jié)作用，提示可能原因在于RyR通道的“鈣閃爍”激活膜上Kca通道及和抑制VDCC通道的鈣內流，從而降低膜興奮性和收縮活性，同時發(fā)現(xiàn)OAB膀胱逼尿肌中RyR通道在離體的自發(fā)收縮活性調節(jié)中功能減弱和它的表達顯著降低。提示RyR通道在正常逼尿肌自發(fā)收縮中負性作用機制在OAB膀胱逼尿肌中表現(xiàn)明顯減弱，這可能是導致OAB膀胱逼尿肌自發(fā)收縮的過度活躍