MDM2基因與淋巴瘤-白血病相關(guān)性的分子機(jī)制初步研究.pdf

1、研究背景淋巴瘤/白血病是淋巴造血系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。在我國(guó)惡性淋巴瘤發(fā)病率占惡性腫瘤總數(shù)3％-4％，居惡性腫瘤第11位。白血病的年發(fā)病率2.76/10萬(wàn)，是青少年最常見的惡性腫瘤?；蛞孜坏冗z傳物質(zhì)的異常在淋巴瘤/白血病中較常見，提示基因結(jié)構(gòu)和功能的異常在淋巴瘤/白血病的發(fā)病機(jī)制中可能占有十分重要的地位，淋巴瘤/白血病相關(guān)基因的功能研究成為目前研究熱點(diǎn)。 近年來(lái)MDM2與淋巴瘤/白血病的關(guān)系逐漸受到重視。MDM2是一種癌基因，它

2、的蛋白分子結(jié)構(gòu)包含了多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，不僅可結(jié)合p53蛋白，同時(shí)還能與E2F1、Rb等重要基因產(chǎn)物相結(jié)合，從而影響細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等重要生命過程。MDM2致癌作用包括兩方面的機(jī)制：抑制p53等抑癌基因的抗腫瘤活性以及直接的致癌作用。MDM2被視為p53最重要的負(fù)性調(diào)控基因之一，MDM2擴(kuò)增和(或)過表達(dá)導(dǎo)致野生型p53失活，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展；另一方面MDM2異?？梢灾苯右鹫＜?xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。研究MDM2及其相關(guān)基因?qū)?/p>

3、腫瘤防治具有重要的價(jià)值。在淋巴瘤/白血病中MDM2主要以過表達(dá)形式存在，已往的研究顯示MDM2與淋巴瘤/白血病之間存在相關(guān)性，但是其中的分子機(jī)制仍未被闡明。本實(shí)驗(yàn)以石蠟包埋淋巴瘤組織和淋巴瘤/白血病細(xì)胞株作為研究對(duì)象，通過免疫組化、RT-PCR、Westernblot、RNA干擾等研究方法，初步探討MDM2與淋巴瘤/白血病相關(guān)性及其分子機(jī)制。 全文分四部分。第一章MDM2基因及相關(guān)基因與非霍奇金淋巴瘤的關(guān)系目的回顧性調(diào)查MDM2

4、在淋巴瘤中的表達(dá)情況，探討MDM2與淋巴瘤相關(guān)性。 方法與結(jié)果1收集190例石蠟包埋非霍奇金淋巴瘤組織，光鏡下觀察每例HE切片典型病變區(qū)域，然后在相應(yīng)蠟塊的兩個(gè)不同位置各選取一塊微組織塊用于制備組織芯片。經(jīng)常規(guī)染色和免疫組化檢測(cè)，組織芯片符合實(shí)驗(yàn)要求。 2采用免疫組化SP方法，在組織芯片上檢測(cè)MDM2，p53，p21，Bax，Ki-67共5個(gè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)MDM2在不同類型淋巴瘤陽(yáng)性率差異很大，在侵襲性淋巴瘤表達(dá)較高而在惰性

5、淋巴瘤未檢出MDM2；在DLBCL中MDM2陽(yáng)性率與Bax的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；在ALCL中，MDM2高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞高增殖指數(shù)呈正相關(guān)；在PTCL中與突變型p53密切相關(guān)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDM2與侵襲性強(qiáng)，臨床預(yù)后較差的淋巴瘤類型具有較密切的相關(guān)性，提示MDM2可促進(jìn)淋巴瘤發(fā)展，有可能作為評(píng)價(jià)淋巴瘤惡性程度和臨床預(yù)后的指標(biāo)。 第二章RNAi干擾MDM2在淋巴瘤/白血病細(xì)胞中的表達(dá)目的通過RNAi建立暫時(shí)性和穩(wěn)定性MDM

6、2表達(dá)下調(diào)的淋巴瘤/白血病細(xì)胞系。 方法和結(jié)果1構(gòu)建重組shRNA表達(dá)載體從大腸桿菌DH5α提取表達(dá)載體pSilencer4.1-CMVneoDNA，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，與合成的DNA模板鏈連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α得到陽(yáng)性菌落；增菌培養(yǎng)后提取載體DNA進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證實(shí)表達(dá)shRNA的DNA模板鏈已成功插入載體的正確位置。針對(duì)MDM2基因的重組shRNA表達(dá)載體命名pMDM2-shRNA，無(wú)功能shRNA表達(dá)載體

7、命名為pCMV。 2轉(zhuǎn)染和篩選攜帶重組shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用lipofectamine2000將化學(xué)合成的siRNA導(dǎo)入K562和Jurkat細(xì)胞；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染采用lipofectamine2000將重組shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入G418篩選抗性細(xì)胞，10-14d完成篩選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定：擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提細(xì)胞基因組DNA，用載體測(cè)序引物擴(kuò)增出相應(yīng)的±243bp條帶；在轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別

8、加入1000μg/mLG4183-6d后，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞幾乎全部死亡，轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞死亡；轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含300μg/mlG418培養(yǎng)基培養(yǎng)2個(gè)月，細(xì)胞保持穩(wěn)定增殖。實(shí)驗(yàn)證實(shí)成功篩選出攜帶重組shRNA表達(dá)載體的Jurkat和K562細(xì)胞系。 3MDM2基因表達(dá)下調(diào)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成siRNA的細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MDM2siRNA的K562、Jurkat細(xì)胞株MDM2蛋白表達(dá)下

9、降60-70％。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時(shí)提取mRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行多重RT-PCR和Westernblot檢測(cè)。相對(duì)于轉(zhuǎn)染pCMV的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的Jurkat細(xì)胞經(jīng)多重PCR結(jié)果顯示，MDM2mRNA表達(dá)下降超過60％，同時(shí)Westernblot結(jié)果顯示MDM2蛋白表達(dá)減少55％以上。另一方面，多重PCR和Westernblot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的K562細(xì)胞MDM2表達(dá)明顯下降，在mRNA和蛋白

10、質(zhì)水平分別下降70％以上。 結(jié)論瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染均能有效干擾MDM2基因表達(dá)，表明RNAi是研究MDM2基因功能快速、高效的工具。 第三章MDM2敲低后對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞生物學(xué)特性和基因表達(dá)的影響 目的探討MDM2基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性和基因表達(dá)的影響 方法和結(jié)果通過測(cè)定和比較轉(zhuǎn)染pCMV和轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，倍增時(shí)間延長(zhǎng)。分

11、別用70％乙醇固定轉(zhuǎn)染pCMV和轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA細(xì)胞，用PI法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA細(xì)胞的改變主要表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增加，S期和G2-M期的細(xì)胞減少。轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的K562細(xì)胞凋亡明顯增加。 提取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，用Westemblot檢測(cè)不同基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示隨著MDM2基因的表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變。與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染M

12、DM2siRNA的Jurkat和K562細(xì)胞中E2F1和p65的表達(dá)均有不同程度下降，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的Jurkat和K562細(xì)胞中，E2F1基因表達(dá)明顯下降；p65在K562細(xì)胞中表達(dá)下降明顯，在Jurkat細(xì)胞中p65輕度下降；K562細(xì)胞p21表達(dá)增加。 結(jié)論MDM2基因表達(dá)下調(diào)明顯影響淋巴瘤/白血病細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性以及多種基因表達(dá)，提示MDM2有可能作為淋巴瘤/白血病治療的潛在新靶點(diǎn)。 第

13、四章MDM2表達(dá)下調(diào)對(duì)淋巴瘤/白血病細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的影響目的探討發(fā)生DNA損傷和細(xì)胞毒性作用時(shí)MDM2基因在淋巴瘤/白血病細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用。 方法和結(jié)果短時(shí)間(非致死性)UV照射后，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)相對(duì)于轉(zhuǎn)染pCMV的細(xì)胞而言，轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA的Jurkat細(xì)胞和K562細(xì)胞前3天處于生長(zhǎng)抑制狀態(tài)，直至第4天以后細(xì)胞才逐漸恢復(fù)增殖活性。長(zhǎng)時(shí)間UV照射和1μg/mlMTX作用后，用70％乙醇固定細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

14、情況，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于轉(zhuǎn)染pCMV細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pMDM2-shRNA細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡增加；加入1μg/mlMTX24hr后提取細(xì)胞總蛋白，Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染MDM2shRNA的K562和Jurkat細(xì)胞Rb基因和Bax基因表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)染pCMV細(xì)胞。 結(jié)論MDM2表達(dá)下調(diào)后淋巴瘤/白血病細(xì)胞對(duì)DNA損傷因子和細(xì)胞毒性因子的敏感性增高，提示MDM2基因在淋巴瘤/白血病細(xì)胞中可能具有抗損傷和抗凋亡作用。