DNA-PKcs對鹽誘導激酶SIK2的調(diào)節(jié).pdf

1、敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性，研究DNA-PKcs對SIK2蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)作用。體外純化SIK2蛋白，檢測DNA-PKcs對SIK2的磷酸化調(diào)節(jié)作用，進一步明確DNA-PKcs磷酸化SIK2的位點及調(diào)節(jié)機制。
　　敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性，首先觀察SIK2蛋白的變化；然后細胞經(jīng)放線菌酮CHX處理后，Western blot檢測DNA-PKcs對SIK2蛋白的半壽期影響。利用免疫共沉淀技術處理DNA-PKcs敲

2、低細胞（或抑制其激酶活性），檢測DNA-PKcs對SIK2蛋白泛素化降解的影響。構建His標簽的SIK2重組質(zhì)粒，導入BL21感受態(tài)細胞中原核誘導SIK2蛋白表達，并且進行體外純化。建立體外磷酸化反應體系，研究DNA-PKcs對SIK2的體外磷酸化調(diào)節(jié)作用，并通過質(zhì)譜分析檢測SIK2自磷酸化和磷酸化位點。用32P標記DNA，EMSA電泳檢測SIK2能否結合DNA，并檢測DNA-PKcs對SIK2結合DNA是否有調(diào)節(jié)作用。
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3、stern blot結果顯示，敲低或抑制 DNA-PKcs，SIK2的表達量下降;放線菌酮 CHX處理DNA-PKcs敲低細胞（或抑制其激酶活性），SIK2蛋白的半壽期縮短。免疫共沉淀結果顯示，敲低或抑制DNA-PKcs的激酶活性，SIK2蛋白的泛素化程度明顯增強。原核誘導表達結果顯示，成功構建His標簽SIK2重組質(zhì)粒，并在體外誘導表達，且純化出SIK2蛋白。體外磷酸化反應結果顯示，SIK2可以發(fā)生自磷酸化，DNA-PKcs可以磷酸化

4、SIK2，且SIK2抑制DNA-PKcs的自磷酸化；質(zhì)譜分析確定SIK2的S358、S515、S534位點發(fā)生自磷酸化和DNA-PKcs在S512、S515、S534位點磷酸化SIK2。DNA Binding實驗結果顯示，SIK2可以結合DNA，且DNA-PKcs可以增強SIK2對DNA的結合；DNA-PKcs也可以結合DNA，而SIK2卻抑制DNA-PKcs與 DNA的結合。
　　實驗發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs可以調(diào)節(jié)SIK2的穩(wěn)定性

5、，敲低或抑制其激酶活性，SIK2的表達量降低并且半壽期縮短，泛素化降解增強。SIK2可以自磷酸化，其自磷酸化位點為S358、S515、S534；DNA-PKcs可以磷酸化SIK2，其磷酸化位點為S512、S515、S534。DNA-PKcs可以發(fā)生磷酸化，且SIK2抑制其自磷酸化。SIK2可以結合DNA，并且DNA-PKcs能夠增強SIK2與DNA的結合。DNA-PKcs可以結合DNA，但是SIK2抑制DNA-PKcs與 DNA的結合。