電離輻射后少突膠質細胞基因表達譜改變的實驗研究.pdf

1、在大腦、頭頸部腫瘤和一些顱內良性疾病的治療中，大腦和脊髓等重要的劑量限制性器官往往會臨近或位于射野范圍之內，放射治療后除了部分病人死于腫瘤局部未控之外，約有50%的長期生存患者會發(fā)生不同程度的放射性后遺癥，其中以放射性腦或脊髓損傷的病情較為嚴重，患者的生活質量明顯降低?；谝陨显?，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的電離輻射效應的研究已經(jīng)全面展開。目前對于放射性腦損傷發(fā)病機理和早期診斷的研究還相對較少

2、，至今仍無有效的早期診斷和治療措施，所以這些研究工作對腫瘤放射治療學的發(fā)展有著重要的理論意義和應用價值。 病理學改變的研究表明，早期腦損傷以血管系統(tǒng)變化為主，沒有特異性；晚期則出現(xiàn)較典型的脫髓鞘、膠質細胞增生與退行性改變、毛細血管阻塞和白質壞死等四大特征。由于血管損傷的廣泛性和少突膠質細胞（oligodendrocyte，OL）是CNS中唯一能合成髓鞘的細胞，因此血管內皮細胞和OL被確立為放射性腦損傷的輻射靶細胞，OL成為發(fā)病機

3、理研究的重點之一。隨著研究的深入，目前認為主要有四種因素參與了放射性腦損傷的發(fā)生與發(fā)展，其分別是：血管損傷、少突膠質前體細胞及成熟OL耗竭、神經(jīng)干細胞減少和細胞因子表達異常。 近幾年來，關于OL方面的研究大多集中于細胞和分子水平，主要內容包括電離輻射后OL的凋亡及其發(fā)生機制、少突膠質前體細胞和成熟OL的輻射反應性以及輻射劑量與分割方式影響等方面。然而，對于OL的研究沒有與發(fā)生放射性脫髓鞘病變機制形成密切的相關性；早期和亞急性期細

4、胞、分子反應的特性與晚期損傷病理學改變的關系仍不清楚。在神經(jīng)病學和神經(jīng)生物學領域的研究中，有許多關于“OL損傷”和“脫髓鞘病變”的文獻報道，脫髓鞘是普遍的或特征性的病變，OL也被證實是多種致病因素（外傷、缺血、缺氧和異常免疫反應等）易受攻擊的靶細胞。目前的研究表明少突膠質細胞系各階段的特異性標志分子已基本明確，可以通過不同標記物的組合來區(qū)分它們；少突膠質—2型星形膠質前體細胞（oligodendrocyte—type2 astrocyt

5、e progenitor cells，O2A）離體培養(yǎng)的成功也為研究其增殖、遷徙、分化特性及與脫髓鞘病變的關系提供了實驗細胞模型；在正常成年大腦與脊髓內存在著約占膠質細胞5～8%的具有分化潛能的前體細胞，一定程度的損傷性刺激后可以使它們發(fā)生增殖、遷徙、分化和再生，這為神經(jīng)損傷的治療提供了新的思路。 一、少突膠質細胞純化培養(yǎng)的實驗研究 目的:獲得芯片檢測所需要的純化OL。 方法:采用改良的恒溫振蕩、差速貼壁法進行O

6、2A的純化培養(yǎng)，并通過體外誘導分化使之為成熟的OL；應用免疫熒光雙重標記方法進行OL的細胞鑒定。 結果: OL免疫熒光標記為A285標記陰性、MBP或GalC標記陽性；OL純度達98%，且細胞數(shù)量達到5×106個。 二、電離輻射后少突膠質細胞基因表達譜變化的離體實驗 目的:觀察電離輻射前后OL基因表達的早期變化規(guī)律。 方法:對純化的OL采用6MV—X線照射10Gy劑量，用表達譜芯片檢測比較對照組（1組）與

7、照射后1hr、4hr組（2、3組）各基因mRNA表達的變化。 結果:三組細胞雜交后的基因檢出率分別為42.81%、41.64%、45.31%；2比1上調基因數(shù)為27個，下調基因數(shù)為164個，3比1上調基因數(shù)為295個，下調基因數(shù)為302個，3比2上調基因數(shù)為510個，下調基因數(shù)為320個；基因功能分類結果共有79大類1079個基因被列出，具體功能分類包括：細胞生理過程、腫瘤凋亡、新陳代謝、細胞周期、細胞通訊、蛋白結合等。

8、 三、與早期放射性腦損傷相關的功能基因定量分析 目的:驗證芯片結果可靠性的同時進一步探討候選基因在OL內差異表達的意義。 方法:依據(jù)芯片檢測結果選出9個在早期放射性腦損傷中可能發(fā)揮重要調控作用的候選基因，應用實時熒光定量RT—PCR的方法對其mRNA進行定量分析。 結果;熒光定量RT—PCR基因定量與基因芯片分析結果比較，27個mRNA檢測結果中有22個結果一致，符合率為81.5%；三組樣本中各基因△Ct值分別為

9、：①膠質原纖維酸性蛋白：1.3777、2.2266、5.3992；②髓鞘堿性蛋白：—3.4061、—2.6133、—2.0232；③載脂蛋白E：12.1203、14.7452、17.2264；④促甲狀腺激素釋放激素：5.8994、8.2740、2.4709；⑤甲狀腺激素受體α：6.3269、5.8081、6.4793；⑥轉化生長因子β2：4.6782、5.2108、5.1181；⑦早期生長反應2：10.0840、7.4766、8.575

10、4；⑧神經(jīng)細胞黏附分子1：3.7024、3.9211、5.6716；⑨S100蛋白β多肽：2.5607、5.5696、4.2581。 結論： 1.通過改良的恒溫振蕩法和差速貼壁法進行O2A的純化培養(yǎng)，并誘導分化為純化的OL，免疫熒光標記為A285標記陰性、MBP或GalC標記陽性；OL純度達98%，且細胞數(shù)量達到5×106個，符合基因芯片檢測要求。 2.照射后早期就發(fā)生了電離輻射導致的OL基因表達譜的改變；芯片檢

11、測結果提示發(fā)生變化的OL基因包括細胞損傷相關基因、細胞保護相關基因和損傷修復相關基因，這些基因之間的動態(tài)平衡變化決定了輻射對OL的最終生物學效應。 3.應用實時熒光定量RT—PCR的方法對候選基因mRNA進行定量分析，結果與芯片檢測基因mRNA的結果基本一致，兩者比較在檢測的特異性上更加近似，而檢測的敏感性上前者優(yōu)于后者；對侯選基因mRNA進行定量分析，進一步了解了它們在放射性腦損傷早期的變化情況，GFAP、MBP、apoE、T