高糖培養(yǎng)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞中四氫生物蝶呤對一氧化氮生成的影響.pdf

1、目的：研究高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MC)中四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)合成水平的變化，并探討其對一氧化氮(nitric oxide，NO)生成的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：大鼠腎小球系膜細(xì)胞株同步化培養(yǎng)后分為正常糖濃度組（NG組，5.56mmol/L葡萄糖）、甘露醇對照組（MA組，5.56mmol/L葡萄糖+19.44mmol/L甘露醇）、高糖組（HG組，25m

2、mol/L葡萄糖）、抗氧化劑組（HG+NAC組，25mmol/L葡萄糖+50μmol/LNAC）、BH4抑制劑組（HG+DAHP組，25mmol/L葡萄糖+2mmol/LDAHP）、過氧化氫組(H2O2組，10-6mol/LH2O2)、過氧化氧聯(lián)合BH4抑制劑組(H2O2+DAHP組，10-6mol/LH2O2+2mmol/LDAHP)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)10h后，應(yīng)用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FL)測定細(xì)胞內(nèi)BH4水平；以Gr

3、iess比色法測定培養(yǎng)上清中NO水平，以DAF-FM DA探針測定細(xì)胞內(nèi)NO的水平；生物化學(xué)法檢測iNOS蛋白活性；分別用Western Blot法及RT-PCR法檢測iNOS蛋白表達(dá)及mRNA水平；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法測定吸光度OD值反映細(xì)胞增殖活力；流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果：所有指標(biāo)均顯示NG組與MA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余

4、各組相關(guān)指標(biāo)變化如下：
　　 1．BH4含量的變化
　　 與NG組比較，HG組和H2O2組BH4水平均顯著增高(P＜0.01)；與HG組比較，HG+NAC組BH4水平顯著降低(P＜0.01)。
　　 2．NO生成的變化
　　 結(jié)果：顯示各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO水平的變化與細(xì)胞內(nèi)NO水平變化趨勢基本相同。與NG組比較，HG組和H2O2組NO生成均顯著增高(P＜0.01)；與HG組比較，HG+NAC組、HG

5、+DAHP組NO生成量均顯著降低(P＜0.01)；與H2O2組比較，H2O2+DAHP組NO生成量顯著降低(P＜0.01)。
　　 3．iNOS轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及活性的差異
　　 各處理組細(xì)胞iNOS轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及活性變化趨勢基本相同。HG組、H2O2組與NG組比較，iNOS轉(zhuǎn)錄、表達(dá)明顯增加，活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，或P＜0.05）；與HG組比較，HG+NAC組、HG+DAHP組iNOS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)降低，活性減

6、弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，或P＜0.05）；與H2O2組比較，H2O2+DAHP組iNOS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)降低，活性減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，或P＜0.05）。
　　 4．細(xì)胞增殖
　　 MTT結(jié)果顯示：與NG組比較，HG組及H2O2組OD值均顯著較高(P＜0.01)；與HG組比較，HG+NAC組和HG+DAHP組OD值均較低（P＜0.05，或P＜0.01）；與H2O2組比較，H2O2+DAHP組OD值顯

7、著較低(P＜0.01)。
　　 5．各處理因素對細(xì)胞周期的影響
　　 與NG組比較，HG組及H2O2組，G0/G1期細(xì)胞比例均明顯升高(P＜0.05)，S期細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.05)；與HG組相比，HG+NAC組和HG+DAHP組的G0/G1期細(xì)胞比例均顯著降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05）；與H2O2組相比，H2O2+DAHP組G0/G1期細(xì)胞比例均有顯著降低(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例