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1、研究的目的和意義: 本研究在加入生長(zhǎng)因子的條件下,以小分子化合物作為凋亡誘導(dǎo)劑,對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡機(jī)理進(jìn)行了初步探討。這些研究可加深對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理的認(rèn)識(shí),為研究腫瘤血管退化的機(jī)制提供重要參考資料,有望為肺腺癌的有效治療提供重要啟迪。 研究?jī)?nèi)容:1. 以嗎啉酮衍生物作為誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的工具,研究A549細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分布、P53和Fas蛋白累積量之間的關(guān)系。 2.觀察分析苯并嗯嗪衍
2、生物對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,篩選能夠有效抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性小分子。 3.進(jìn)一步分析2中篩選出的苯并嗯嗪衍生物3f對(duì)A549細(xì)胞自噬性死亡的誘導(dǎo)作用。 4.在上述實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)DBO處理導(dǎo)致A549細(xì)胞中的膜整連蛋白β4顯著下調(diào),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了膜整連蛋白β4在A549細(xì)胞自噬性死亡的作用。 5.生長(zhǎng)因子FGF-2存在的條件下,DBO誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究及其對(duì)血管形成的影響.
3、 研究方法:1.細(xì)胞死亡方式的檢測(cè)。 2.細(xì)胞內(nèi)蛋白水平及分布的檢測(cè): 2.1免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù),檢測(cè)P53、Fas、膜整連蛋白β4和MAP1 LC3-Ⅱ蛋白含量及其分布的變化。 2.2 Western blot法檢測(cè)P53、膜整連蛋白β4蛋白累積量的變化。 3.DBO對(duì)A549細(xì)胞基因表達(dá)的影響利用人類(lèi)全基因組cDNA芯片檢測(cè)小分子化合物DBO對(duì)A549細(xì)胞基因表達(dá)的影響,具體參
4、考Patterson的方法[Patterson et al.,2006]4.RIS1,F(xiàn)ST,RIN2,RAB5B和膜整連蛋白β4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳相結(jié)合,檢測(cè)Ras誘導(dǎo)衰老基因(RIS1),濾泡素抑制素(FST),Ras與Rab相互作用因子2(RIN2),RAB5B和膜整連蛋白β4在mRNA水平上的變化。 5.RNAi干擾蛋白表達(dá): 利用RNAi技術(shù)下調(diào)膜整連蛋白β4在A54
5、9細(xì)胞中的表達(dá)后,檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化,并采用TUNEL,LDH活性檢測(cè),AO染色和MAP1 LC3-Ⅱ免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)等方法鑒別細(xì)胞的死亡方式。 6.血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng): 參考Jaffe等的方法[Jaffe et al.,1973]7.ROS檢測(cè): 利用熒光探針(DCHF)結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)8.SOD活性檢測(cè): 利用SOD檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 9.N
6、ADPH氧化酶活性檢測(cè): 參考Li等的方法[Li et al,2002]10.體內(nèi)外血管形成模型: 10.1 Matrigel血管形成模型:參考Kureishi等的方法[Kureishi et al.,2000]10.2雞胚尿囊膜(CAM)模型:參考Zhao等的方法[Zhao et al,2005]. 研究結(jié)果: 1.嗎啉酮衍生物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制1.1在48 h內(nèi),三種嗎啉酮衍生物(化合物
7、1,2和3,圖1)以濃度依賴的方式顯著降低A549細(xì)胞存活率(圖2)。 1.2流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明,40μg/ml嗎啉酮衍生物化合物1處理A549細(xì)胞48h后,與對(duì)照組相比,S期細(xì)胞所占比例下降,而G0/G1和G2/M期細(xì)胞比例上升。化合物2和3處理后,S期和G2/M期細(xì)胞所占比例均下降,而G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升(圖3)。 1.3倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示,40μg/ml的嗎啉酮衍生物1,2和3分別處理A549
8、細(xì)胞48h后,細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài):胞體皺縮,胞漿內(nèi)空泡明顯,核固縮,折光性減弱,凋亡小體樣結(jié)構(gòu)形成(圖4)。其中,化合物3的作用效果尤為明顯。 1.4 AO染色后利用熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),40μg/ml的嗎啉酮衍生物1,2和3分別處理A549細(xì)胞48h后,細(xì)胞也呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集且邊緣化明顯、核碎裂,凋亡小體清晰可見(jiàn)(圖5)。其中化合物3是三種嗎啉酮衍生物中誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的最有效分子。
9、 1.5 40μg/ml的嗎啉酮衍生物1,2和3分別處理A549細(xì)胞48h后,細(xì)胞內(nèi)P53蛋白含量明顯增加,并向細(xì)胞核中聚集(圖6)。細(xì)胞內(nèi)Fas蛋白水平顯著升高,在細(xì)胞膜上的分布也發(fā)生明顯改變。在對(duì)照組,F(xiàn)as彌散在整個(gè)細(xì)胞表面;而在化合物處理組,F(xiàn)as蛋白在細(xì)胞膜上聚集成帽狀,并有向細(xì)胞的一端遷移的趨勢(shì)(圖7)。嗎啉酮衍生物通過(guò)Fas通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制與本實(shí)驗(yàn)室以前研究的黃樟素氧化物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制類(lèi)似,
10、故對(duì)其誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理未做更深入的研究。 2.苯并口惡嗪衍生物初步篩選結(jié)果(MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率)在24-48h,200和400μM苯并口惡嗪衍生物化合物3c,3d和3f都能夠顯著地抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)(p<0.05,圖9),而化合物3a,3b,3e和3g對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(圖10)。其中化合物3f(6,8-二氯-2,3-二氫-3-羥甲基-1,4-苯并口惡嗪,DBO)的抑制效果最為明顯。 3.
11、DBO誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬性死亡及其分子機(jī)制3.1 200μM DBO處理A549細(xì)胞48h時(shí),與對(duì)照組相比,G0/G1和G2/M期細(xì)胞所占比例明顯上升(圖12),P53蛋白含量顯著增加(p<0.05,圖13),而膜整連蛋白β4的含量明顯減少(p<0.05,圖14)。說(shuō)明DBO極有可能通過(guò)上調(diào)P53蛋白、下調(diào)膜整連蛋白β4的含量,阻滯細(xì)胞于G1期,從而抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。 3.2 TUNEL和LDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn),200μM DBO處理A
12、549細(xì)胞48h時(shí),細(xì)胞凋亡率和培養(yǎng)液中LDH活性均無(wú)明顯變化(圖16和17),AO染色陽(yáng)性率明顯升高(圖18)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果表明,在DBO處理組LC3-II在細(xì)胞質(zhì)中塊狀聚集,而在對(duì)照組中無(wú)此現(xiàn)象出現(xiàn)(圖19)。這些結(jié)果說(shuō)明DBO既沒(méi)有誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡也沒(méi)有誘導(dǎo)其壞死,而極有可能是引起了A549細(xì)胞的自噬性死亡。 3.3基因芯片的結(jié)果顯示,200μM DBO處理A549細(xì)胞48 h時(shí),共有77個(gè)基因發(fā)生了2倍以上
13、量的顯著變化,其中64(0.3%)個(gè)基因顯著上調(diào),13(0.06%)個(gè)基因明顯下調(diào)(圖20)。基于細(xì)胞生長(zhǎng)率的變化以及酸性膜泡的增多,我們選擇了Ras誘導(dǎo)的衰老相關(guān)基因1(RIS1),濾泡素抑制素(FST),RAB5B和RIN2等4個(gè)基因進(jìn)行了進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析。RT-PCR結(jié)果顯示,隨著DBO處理時(shí)間的延長(zhǎng),A549細(xì)胞中RIS1,F(xiàn)ST和RIN2的表達(dá)水平逐漸上升,RAB5B的表達(dá)水平逐漸下降(圖21)。與其它基因不同的是,膜整連蛋
14、白p4在處理24h恢復(fù)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃剑f(shuō)明膜整連蛋白β4的表達(dá)可能隨細(xì)胞周期的變化而變化。為闡明膜整連蛋白β4在調(diào)控A549肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)利增殖中的作用,我們利用膜整連蛋白β4特異性siRNA干擾其表達(dá)。膜整連蛋白β4下調(diào)后,雖然A549細(xì)胞的凋亡率和培養(yǎng)液中LDH活性均無(wú)明顯變化(圖23),但A549細(xì)胞存活率卻明顯降低(圖22)。進(jìn)一步分析表明,A549細(xì)胞內(nèi)酸性膜泡數(shù)量明顯增多,LC3-II的表達(dá)顯著增強(qiáng)、且呈斑塊狀聚集(圖
15、24),RIS1,F(xiàn)ST和RIN2基因的表達(dá)明顯增強(qiáng),而RAB5B的表達(dá)明顯減弱(圖25)。意味著膜整連蛋白β4,RIS1,F(xiàn)ST,RAB5B和RIN2可能參與調(diào)控A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和自噬性死亡過(guò)程。 4.生長(zhǎng)因子FGF2存在的條件下,DBO誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制4.1 50μM DBO處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞24h后,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膜整連蛋白β4的含量顯著增加(圖26),細(xì)胞凋亡率從21.3%上升到68.5%(p
16、<0.01,圖27)。 4.2 50μM DBO處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞12h時(shí),細(xì)胞內(nèi)的ROS和NO水平顯著提高(圖28和30A)。酶活分析表明細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶和iNOS的活性顯著升高,而SOD和eNOS的活性無(wú)顯著變化(圖29和30B)。這意味著極有可能是由于NADPH氧化酶活性升高導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加,而iNOS活性的升高導(dǎo)致了NO含量增加。但在DBO處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞前,若先用NADPH氧化酶的特異性
17、抑制劑DPI處理細(xì)胞30分鐘,則細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的含量均不能顯著提高(圖31),預(yù)示著在血管內(nèi)皮凋亡中,NO的產(chǎn)生可能通過(guò)NADPH氧化酶與ROS代謝有關(guān)聯(lián)。 5.DBO對(duì)體內(nèi)外血管形成的影響50μM DBO處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞24h時(shí),分化形成的毛細(xì)血管樣血管的數(shù)量最多。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),血管形成被抑制。到72h的時(shí)候,在DBO處理組幾乎看不到毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)存在(圖32)。DBO(10-40nmol)處理雞胚尿囊膜3天
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