肝癌干細(xì)胞生物學(xué)特征及個(gè)體化化療應(yīng)用研究.pdf

1、背景： 原發(fā)性肝癌手術(shù)機(jī)會(huì)少，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，綜合治療在肝癌中具有非常重要的地位?；熥鳛榫C合治療的主要手段之一，對(duì)實(shí)體瘤有效率仍維持在20～50％，對(duì)實(shí)體瘤臨床治愈的貢獻(xiàn)僅為5％。而肝癌化療效率低下的特點(diǎn)則相對(duì)其他實(shí)體瘤更加突出。 腫瘤的個(gè)體差異，以及化療中腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的改變，是化療失敗的重要原因。近來不少專家提出腫瘤化療應(yīng)該是規(guī)范下的個(gè)體化化療。事實(shí)上，在實(shí)體瘤中，患者的年齡、表面受體表達(dá)情況以及腫瘤病理類型等不

2、同，治療的選擇也有所差異，已經(jīng)開始個(gè)體化化療的雛形，并且取得了一定的效果。但是，大多數(shù)實(shí)體瘤的個(gè)體化化療，特別是肝癌，進(jìn)展相當(dāng)緩慢。 腫瘤干細(xì)胞的研究是近年來實(shí)體腫瘤研究的重要成果，并對(duì)實(shí)體瘤認(rèn)識(shí)產(chǎn)生了重大影響。研究發(fā)現(xiàn)，只要存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤就難以治愈。因而，如果建立針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的個(gè)體化化療方案，殺傷腫瘤干細(xì)胞，對(duì)于實(shí)現(xiàn)肝癌的個(gè)體化化療有重要的研究價(jià)值。 本項(xiàng)研究先探討持續(xù)化療下，肝癌細(xì)胞生物學(xué)特征改變情況，了解個(gè)

3、體化化療的必要性。利用腫瘤干細(xì)胞與成體干細(xì)胞的關(guān)系，根據(jù)卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記，研究肝癌細(xì)胞不同亞群的成瘤能力，尋找肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，并且研究其生組間均無相關(guān)性。(2)應(yīng)用不同藥物刺激HEPG2細(xì)胞6個(gè)周期，對(duì)MRP抗體表達(dá)總量進(jìn)行相關(guān)性分析：ADM組與5-FU組，相關(guān)系數(shù)r=-0.208，P=0.693；ADM組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=0.094，P=0.860；ADM組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.168，P=0.751；5-FU組與DDP

4、組，相關(guān)系數(shù)r=0.786，P=0.064；5-FU組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=0.553，P=0.255；DDP組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.645，P=0.167。組間均無相關(guān)性。(3)應(yīng)用不同藥物刺激HEPG2細(xì)胞6個(gè)周期，對(duì)LRP抗體表達(dá)總量進(jìn)行相關(guān)性分析：ADM組與5-FU組，相關(guān)系數(shù)r=-0.370，P=0.470；ADM組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=0.396，P=0.437；ADM組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.387，P=0.4

5、49；5-FU組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=-0.029，P=0.957；5-FU組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=0.975，P=0.001；DDP組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.166，P=0.754。除了5-FU組與聯(lián)合組之間有正相關(guān)性，并且相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他組間均無相關(guān)性。(4)應(yīng)用不同藥物刺激HEPG2細(xì)胞6個(gè)周期，對(duì)erbB-2抗體表達(dá)總量進(jìn)行相關(guān)性分析：ADM組與5-FU組，相關(guān)系數(shù)r=0.920，P=0.009；ADM組與DDP組

6、，相關(guān)系數(shù)F0.128，P=0.809；ADM組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.402，P=0.430；5-FU組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=0.020，P=0.970；5-FU組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.246，P=0.639；DDP組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.644，P=0.151。除ADM組與5-FU組有正相關(guān)性外，其他組間無相關(guān)性。(5)應(yīng)用不同藥物刺激HEPG2細(xì)胞6個(gè)周期，對(duì)c-myc蛋白表達(dá)總量進(jìn)行相關(guān)性分析：ADM組與5-F

7、U組，相關(guān)系數(shù)r=-0.262，P=0.616；ADM組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=0.600，P=0.208；ADM組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)F0.151，P=0.775；5-FU組與DDP組，相關(guān)系數(shù)r=-0.725，P=0.103；5-FU組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=-0.018，P=0.972；DDP組與聯(lián)合組，相關(guān)系數(shù)r=0.391，P=0.443。組間均無相關(guān)性。結(jié)論：不同化療藥物持續(xù)刺激下，肝癌細(xì)胞耐藥與增殖等生物學(xué)特征變化不同。提示在

8、臨床化療中，個(gè)體化治療不可忽視。 對(duì)應(yīng)細(xì)胞亞群分別為46.6±3.3％(G1)，26.6±1.8％(S)與26.8±3.5％(G2M)，比較t值與P值分別為：t=8.544，P＜0.001；t=7.341，P＜0.001；t=4.259，P=0.004。亞群間各周期均有顯著性差異。CK7陰性細(xì)胞細(xì)胞周期分布為63.2±4.2％(G1)，20.2±1.9％(S)與16.6±4.7％(G2M)，對(duì)應(yīng)細(xì)胞亞群細(xì)胞分別為46.7±4.0

9、％(G1)，28.4±3.3％(S)與25.0±6.3％(G2M)，亞群之間比較，t值與P值分別為：t=10.352，P＜0.001；t=6.308，P＜0.001；t=3.324，P=0.013，亞群間各周期均有顯著性差異。(5)強(qiáng)成瘤能力亞群按照免疫分選方法連續(xù)純化5次(5個(gè)純化周期)，Thy-1(+)細(xì)胞特征表面標(biāo)記表達(dá)率分別為：23.8±4.5，27.1±3.8，29.7±2.9，28.6±2.2與29.4±2.6。CK7(-)

10、特征表面標(biāo)記表達(dá)率分別為：23.8±4.5，27.1±3.8，29.7±2.9，28.6±2.2與29.4±2.6。配伍組方差分析發(fā)現(xiàn)，不同來源大鼠得到的Thy-1陽性細(xì)胞與CK7陰性細(xì)胞，特征表面標(biāo)記表達(dá)率差異顯著，Thy-1(+)：F=5.351，P=0.001，CK7(-)：F=3.515，P=0.008。強(qiáng)致瘤能力亞群純化周期不同，特征表面標(biāo)記表達(dá)率差異也顯著，Thy-1(+)：F=7.994，P＜0.001。SNK法進(jìn)一步兩兩

11、比較發(fā)現(xiàn)，純化周期一與其他4個(gè)周期，以及周期二與周期三均有顯著性差異(P＜0.05)，其他周期間無顯著性差異(P＞0.05)。CK7(-)：F=9.147，P＜0.001。SNK法進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，周期一與其他4個(gè)周期有顯著性差異(P＜0.05)，但是其他周期間無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論：(1)CK7(-)和Thy-1(+)細(xì)胞，具備大鼠肝癌干細(xì)胞的初步特征。大鼠肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志可能包括CK7(-)和Thy-1(+)。(2)

12、肝癌干細(xì)胞具備增殖能力低、致瘤能力強(qiáng)等生物學(xué)行為特征，并且具有分化能力。(3)不同大鼠來源的肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)率不同，提示不同大鼠肝癌干細(xì)胞比例不同。 第三部分間充質(zhì)干細(xì)胞與肝癌干細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn) 目的：研究肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞藥敏相關(guān)性，探討利用間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行針對(duì)肝癌干細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn)的可能性。方法：分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞，阿霉素(0.2μg/mL)、氟尿嘧啶(5μg/mL)及順鉑(1μ

13、g/mL)作用24h后，MTT法分別檢測化療藥物對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的抑制率。同時(shí)，化療藥物作用后的肝癌細(xì)胞移植裸鼠，6周后測量移植瘤重量。氟尿嘧啶與順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率與對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。氟尿嘧啶與順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率與移植瘤重量間進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：(1)阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對(duì)肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率分別為24.79±4.80，28.97±9.05與26.55±5.94。對(duì)肝癌細(xì)胞抑

14、制率分別為：46.50±9.67，55.68±12.53與51.42±10.80。阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對(duì)肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率與對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率比較有顯著性差異，t值與P值分別為：t=6.356，P＜0.001；t=5.006，P=0.001與t=5.743，P=0.001。(2)阿霉素，氟尿嘧啶與順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率與其作用肝癌細(xì)胞后移植瘤重量間進(jìn)行相關(guān)分析，具體相關(guān)系數(shù)為：阿霉素，r=0.245,P=0.559；氟尿嘧啶，F(xiàn)0

15、.144,P=0.734;順鉑，r=0.480,P=0.229，均無相關(guān)性?；熕幬飳?duì)肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率與對(duì)肝癌細(xì)胞間抑制率進(jìn)行相關(guān)分析，具體相關(guān)系數(shù)為：阿霉素，r=0.249,P=0.552；氟尿嘧啶，r=0.073,P=0.863；順鉑，r=0.015,P=0.973,均無相關(guān)性。而化療藥物對(duì)肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率與對(duì)應(yīng)藥物作用后肝癌細(xì)胞移植瘤重量進(jìn)行相關(guān)分析，具體相關(guān)系數(shù)為：阿霉素，r=-0.718，P=0.045；氟

16、尿嘧啶，r=-0.877，P=0.004；順鉑，r=-0.722，P=0.043?；熕幬飳?duì)間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率與肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力有負(fù)相關(guān)性，并且相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：(1)化療藥物對(duì)肝癌大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率小于對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率，間充質(zhì)干細(xì)胞可能類似腫瘤干細(xì)胞，有獨(dú)特的耐藥機(jī)制。(2)化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率不能完全反映肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力?；熕幬飳?duì)間充質(zhì)干細(xì)胞抑制率可以較好反映肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力。應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞，有希望發(fā)展