雙聯(lián)芐類化合物Riccardin D的抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、端粒酶是一種逆轉錄酶，由核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)和蛋白質組成的核糖核蛋白體。它以自身的RNA作為端粒脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid，DNA)復制模版，合成富含dGMP的DNA序列后，添加到染色體末端，并與端粒蛋白結合，保護染色體免于降解、端端融合、重排和丟失，維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。端粒酶在多數(shù)正常細胞中不表達或低表達，而在90％的腫瘤細胞中過度表達。因此，端粒酶被認為是腫瘤細胞的

2、標志物，已經成為腫瘤藥物設計與治療的靶點。
　　Riccardin D是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型雙聯(lián)卞類化合物。前期研究表明，Riccardin D具有抑制腫瘤增殖作用，Riccardin D能在體內外抑制多種腫瘤細胞生長。Riccardin D能顯著降低APCmin+基因小鼠小腸息肉及腺瘤的數(shù)量，表明Riccardin D具有化學預防和治療作用?；谇捌谘芯拷Y果，本研究觀察Riccard

3、inD對腫瘤血管生成及端粒酶活性等方面的抑制作用，并探討其主要作用機制。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　1.Riccardin D對腫瘤微血管生成的抑制作用
　　實驗方法:以人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為靶細胞，以MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip-henyltetrazoliu

4、m bromide，溴化-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5-二苯基四噻唑）法檢測了Riccardin D對HUVEC細胞增殖的抑制作用。以劃痕法檢測了Riccardin D對HUVEC細胞遷移能力的影響。以3D Matrigel管形成法檢測Riccardin D對血管生成的抑制作用。以Western blot法檢測Riccardin D對HUVEC細胞中與血管生成相關蛋白VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2表達水平的影

5、響。以Reversetranscription polymerase chain reaction（RT-PCR，逆轉錄聚合酶鏈反應）法檢測Riccardin D對HUVEC細胞中VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2 mRNA表達水平的影響。以RT-PCR法檢測Riccardin D對人非小細胞肺癌H460細胞中VEGFmRNA表達水平的影響。將裸鼠接種人非小細胞肺癌H460細胞，20 mg/kgRiccardin D尾靜脈

6、注射給藥3周，每3天一次，20 mg/kg Etoposide作為陽性對照藥物，評價Riccardin D對非小細胞肺癌H460生長的抑制作用。將瘤塊取出后，以免疫組織化學方法，檢測腫瘤組織中CD34表達水平，評價Riccardin D對腫瘤血管生成的抑制作用。
　　實驗結果:Riccardin D對HUVEC細胞的增殖具有一定的抑制作用，呈現(xiàn)時間和劑量依賴性的作用特點。以2.5-30μM Riccardin D作用HUVEC細胞

7、，其抑制率為2.2％至28.5％。劃痕實驗表明，Riccardin D能有效地抑制HUVEC細胞遷移。作用12 h及24 h后，Riccardin D對HUVEC細胞的遷移抑制率分別為95.0％和97.7％。Western blot和RT-PCR實驗均顯示，Riccardin D顯著降低HUVEC細胞中EGFR、VEGF、p-VEGFR2和MMP-2表達水平。Riccardin D也能抑制非小細胞肺癌H460細胞中VEGF mRNA表達

8、。3D Matrigel結果顯示，Riccardin D能有效抑制HUVEC細胞形成毛細血管。以5、10、20μM Riccardin D與HUVEC細胞孵育18h，對于新生微血管分支形成的抑制率分別是78.7％、59.0％、29.5％。H460荷瘤裸鼠模型結果顯示，20 mg/kg Riccardin D抑制腫瘤生長率為44.5％，裸鼠體重無明顯下降。免疫組織化學實驗結果表明，Riccardin D明顯抑制腫瘤組織CD34表達水平，腫

9、瘤組織中血管密度降低。
　　實驗結論:Riccardin D具有抑制腫瘤微血管生成的作用。
　　2.Riccardin D對腫瘤細胞端粒酶活性的抑制作用
　　實驗方法:選用人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231，以TRAPeze(R)XL端粒酶活性檢測試劑盒法，檢測Riccardin D對腫瘤細胞端粒酶活性影響。以Western blot及RT-PCR方法，檢測Riccardin D對腫瘤細胞及腫瘤組織中端粒酶活

10、性關鍵蛋白hTERT蛋白表達及mRNA表達的影響。以Western blot及RT-PCR法，檢測Riccardin D對腫瘤細胞端粒保護蛋白TRF2蛋白表達及mRNA表達影響。以免疫熒光染色及Western blot法，檢測Riccardin D對腫瘤細胞DNA損傷標志分子γ-H2AX的影響。以Western blot法，檢測Riccardin D對DNA損傷信號通路蛋白p-ATM、p-Chk2表達的影響。采用MTT法，檢測Ricca

11、rdin D對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的影響。通過建立裸鼠移植入乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231-D3H2LN腫瘤模型，評價Riccardin D對乳腺癌生長抑制作用。以異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/PI雙染、Western blot及原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法，研

12、究Riccardin D對腫瘤細胞凋亡的誘導作用，對poly(ADP)ribose polymerase(PARP)、bax/bcl-2、cysteine-asparticacid proteases(Caspase)-3、Caspase-9等的調節(jié)作用。以流式細胞術及Western blot法，測定Riccardin D對人乳腺癌細胞周期及p53、p21等表達水平的影響。
　　實驗結果:TRAPeze(R)XL端粒酶活性檢測顯示

13、，Riccardin D以劑量依賴性作用方式下調MCF-7和MDA-MB-231細胞端粒酶活性。Western blot顯示，Riccardin D顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞及腫瘤組織中hTERT蛋白表達。RT-PCR顯示，Riccardin D顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞中hTERT mRNA表達。Western blot及RT-PCR顯示，Riccardin D下調MCF-7和MDA-MB-231細

14、胞TRF2蛋白及mRNA表達水平。免疫熒光染色及Western blot顯示，Riccardin D作用后，MCF-7和MDA-MB-231細胞中7-H2AX損傷灶形成增加，γ-H2AX蛋白表達升高。Western blot顯示，Riccardin D上調p-ATM、p-Chk2表達，激活DNA損傷信號通路。MTT顯示，Riccardin D對人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231具有顯著抑制作用，呈現(xiàn)劑量和時間依賴性關系。MCF

15、-7和MDA-MB-231-D3H2LN荷瘤裸鼠模型結果顯示，20 mg/kg Riccardin D對MCF-7腫瘤生長抑制率為47.2％，對MDA-MB-231-D3H2LN腫瘤生長抑制率38.5％，裸鼠體重無明顯下降。AnnexinV-FITC/PI顯示，20μM RiccardinD作用48 h，誘導MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡率分別為32.0％和22.1％。Western blot顯示，Riccardin D提高人

16、乳腺癌細胞PARP、Caspase-3、Caspase-9裂解活化程度及bax/bcl-2比例。流式細胞術顯示，Riccardin D將MCF-7細胞(p53-proficient)周期阻滯于G1期，MDA-MB-231細胞(p53-deficient)周期阻滯于G2/M期。Westem blot顯示RiccardinD上調MCF-7細胞p53和p21表達水平。
　　實驗結論:Riccardin D下調MCF-7和MDA-MB-2