鈍鱗紫背苔苯丙素及聯(lián)芐類(lèi)化合物生物合成機(jī)制研究.pdf

1、苔蘚植物是高等植物中最原始的陸生類(lèi)群，它們已經(jīng)脫離水生環(huán)境進(jìn)入陸地生活。苔蘚植物在適應(yīng)水生到陸生環(huán)境變化的過(guò)程中，積累了種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物不僅在苔蘚植物適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中起著重要作用，而且大多有良好的生物活性，具備一定的藥用價(jià)值。所以研究苔蘚植物活性天然產(chǎn)物的生物合成途徑，闡明其調(diào)控機(jī)制，不僅能為提高生物活性成分含量奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于闡明重要次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的起源與進(jìn)化。
　　植物受到非生

2、物脅迫或生物脅迫時(shí)產(chǎn)生的α，β-不飽和羰基化合物來(lái)源于苯丙烷類(lèi)代謝途徑，此類(lèi)化合物會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而α，β-不飽和雙鍵還原酶能特異性地還原烯醛/酮中的碳-碳不飽和雙鍵，所以在植物脫毒中起到了重要作用。同時(shí)，由于它在還原碳碳雙鍵時(shí)具有立體選擇性，因此是手性分子生物催化合成的重要酶類(lèi)之一。本文從鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)的cDNA文庫(kù)中得到兩個(gè)同源性很高，注釋為α，β-不飽和醛酮還原酶基因的序列

3、，分別命名為PaDBR1和PaDBR2。將它們構(gòu)建到原核表達(dá)載體進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白純化后進(jìn)行體外酶活鑒定，并合成了酶反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果顯示出PaDBR1和PaDBR2對(duì)四種底物對(duì)羥基肉桂醛(p-coumarylaldehyde)、咖啡醛(caffeylaldehyde)、松柏醛(coniferylaldehyde)、5-羥基松柏醛(5-hydroxyconiferylaldehyde)催化活性的不同。酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明PaD

4、BR1和PaDBR2的最適底物均為對(duì)羥基肉桂醛。通過(guò)同源序列比對(duì)與蛋白分子模擬，推測(cè)酶活力的差異可能是由一個(gè)關(guān)鍵氨基酸的不同引起，PaDBR1為半胱氨酸，PaDBR2為酪氨酸。為闡明此現(xiàn)象的機(jī)理，采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)PaDBR1第56位的半胱氨酸進(jìn)行了芳香氨基酸與脂肪族氨基酸的突變，結(jié)果顯示突變?yōu)榉枷憷野彼?、苯丙氨酸的蛋白無(wú)論從底物選擇性還是酶活性均好于PaDBR1，推測(cè)可能是該關(guān)鍵氮基酸與底物中苯環(huán)的堆疊作用所致。
　　黃酮與聯(lián)芐

5、類(lèi)化合物廣泛存在于苔綱植物中，它們具有重要的生理功能，雙聯(lián)芐類(lèi)化合物因其良好的生物學(xué)活性，可作為新藥研究的先導(dǎo)化合物。植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生要受到轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子bHLH家族Ⅲf亞類(lèi)調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的生物合成。苔類(lèi)植物中，由于雙聯(lián)芐類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物都來(lái)自苯丙烷途徑，它們的生物合成共用一些關(guān)鍵的酶，所以bHLH家族Ⅲf亞類(lèi)可能同時(shí)調(diào)控了雙聯(lián)芐的合成。本文采用5'-RACE的方法從鈍鱗紫背苔中克隆得到了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的

6、全長(zhǎng)基因，命名為PabHLH，并擴(kuò)增獲得其基因組DNA序列。構(gòu)建了以GFP作為報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮，確定了PabHLH蛋白定位于細(xì)胞核中。將PabHLH基因構(gòu)建入酵母單雜載體并轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，實(shí)驗(yàn)表明PabHLH具有轉(zhuǎn)錄激活活性。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)PabHLH基因在MeJA與SA處理下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PabHLH的表達(dá)受到MeJA與SA的誘導(dǎo)。將PabHLH構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)及RNAi載體，農(nóng)桿