喹唑啉類化合物抗腫瘤活性的篩選及Erlotinib抗腫瘤新機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤的治療一直是一個(gè)世界性的難題。隨著人們對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑知識(shí)的不斷增加，針對(duì)腫瘤的特異性分子靶點(diǎn)設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物越來越受到關(guān)注。加上晶體衍射技術(shù)、組合化學(xué)、分子模型、高通量篩選技術(shù)以及計(jì)算機(jī)化學(xué)的發(fā)展，靶向性藥物日新月異，為腫瘤的治療提供了新策略?；诮Y(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的藥物設(shè)計(jì)已成為當(dāng)前發(fā)展抗腫瘤藥物的主流方式。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB家族的成

2、員之一，具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，是一種重要的跨膜受體。EGFR信號(hào)通路關(guān)乎細(xì)胞的遷移、黏附、增殖、分化、凋亡，與腫瘤的形成和惡化密切相關(guān)。從1984年EGFR基因首次被克隆，20多年來的研究顯示，EGFR是腫瘤治療中一個(gè)富有前景的靶分子。近年來對(duì)喹唑啉類化合物生物活性的分析可見，該類化合物是一類具有多重藥理作用的小分子化合物，其對(duì)EGFR-TK活性的抑制作用尤為突出。埃羅替尼(Erlotinib)是G

3、enentech公司、Roche公司和OSI公司聯(lián)合開發(fā)的一種小分子EGFR-TK抑制劑(EGFR-TKinhibitor，EGFR-TKI)，屬喹唑啉類化合物。其主要作用機(jī)制為競爭性抑制三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)與EGFR胞內(nèi)催化位點(diǎn)的結(jié)合，降低EGFR的自身磷酸化作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯并走向凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，Erlotinib可誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白p27KIP1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G

4、1期。 雖然對(duì)靶向EGFR的抗腫瘤藥物的研究已取得許多具有里程碑意義的成績，但仍有很多問題亟待解決：如何使此類藥物只作用于腫瘤細(xì)胞的擬定靶點(diǎn)，而不作用于正常細(xì)胞的相同靶點(diǎn)；在聯(lián)合療法中，如何進(jìn)行療效相加或協(xié)同的選擇等。這些都阻礙了靶向EGFR的抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用。因此，關(guān)于靶向EGFR的抗腫瘤藥物的作用機(jī)制和適用范圍等的研究具有深遠(yuǎn)的意義。 本文工作第一部分是在離體水平初步篩選系列喹唑啉類新化合物的抗腫瘤作用并研究其對(duì)

5、TK活性的影響；第二部分以Erlotinib為代表，探討喹唑啉類化合物抗腫瘤作用的新機(jī)制，旨在為腫瘤的分子靶向治療提供新的候選化合物，并為將喹唑啉類化合物發(fā)展為更有效的抗腫瘤藥物積累必要的學(xué)術(shù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 　　第一部分喹唑啉類化合物抗腫瘤活性的篩選目的：篩選系列喹唑啉類新化合物的抗腫瘤作用并研究其對(duì)TK活性的影響。 方法：MTT法測定腫瘤細(xì)胞活力；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent

6、assay，ELISA)試劑盒測定TK活性。 結(jié)果：與Gefitinib、Erlotinib相比，GⅠ系列2-6號(hào)化合物，GⅡ系列2-5號(hào)化合物，GⅣ系列2、6號(hào)化合物，BⅠ系列2～8號(hào)化合物，BⅡ系列2、5、7、8號(hào)化合物明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其中BⅠ系列2～8號(hào)化合物抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于同濃度陽性藥物，最高抑制率超過90％。ELISA法測定21種初篩有效的新化合物對(duì)細(xì)胞TK活性的影響，結(jié)果顯示，GⅠ系列5、6號(hào)化合物，GⅡ系列4

7、、5號(hào)化合物，BⅠ系列8號(hào)化合物，BⅡ系列5、7號(hào)化合物可顯著抑制TK活性。 結(jié)論：七個(gè)系列共計(jì)44種新化合物中，GⅠ系列2-6號(hào)化合物，GⅡ系列2～5號(hào)化合物，GⅣ系列2、6號(hào)化合物，BⅠ系列2～8號(hào)化合物，BⅡ系列2、5、7、8號(hào)化合物能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞株的增殖，體外顯示良好的生物抑瘤作用，BⅠ系列2～8號(hào)化合物作用明顯強(qiáng)于同濃度的Gefitinib、Erlotinib和其他新化合物；其中GⅠ系列5、6號(hào)化合物，GⅡ系列4

8、、5號(hào)化合物，BⅠ系列8號(hào)化合物，BⅡ系列5、7號(hào)化合物對(duì)細(xì)胞TK活性的抑制效應(yīng)顯著(P<0.05)，具有良好的分子靶向性，有望成為腫瘤靶向治療的候選化合物。 　　第二部分Erlotinib抗腫瘤新機(jī)制的研究　　目的：探討Erlotinib抗腫瘤效應(yīng)的新機(jī)制。 方法：hoechst 33342熒光染色測定細(xì)胞凋亡；DCFH-DA熒光探針檢測胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)；提取A54

9、9細(xì)胞線粒體，氧電極法測定線粒體呼吸功能；DHE熒光探針檢測胞內(nèi)超氧化物陰離子(O2)；RT-PCR法測定NADPH氧化酶催化亞基gp91的表達(dá)變化；MTT法測定細(xì)胞活力；JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△ψm)；westem-blotting法測定細(xì)胞色素C，凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)，c-Jun NH2端激酶(c-Ju

10、n NH2一terminal kinase，JNK)磷酸化JNK(p-JNK)的表達(dá)變化。 結(jié)果：1)Erlotinib呈濃度依賴性誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。2)Erlotinib作用30min呈濃度依賴性增加A549細(xì)胞胞內(nèi)的ROS水平。3)Erlotinib呈濃度依賴性增加A549細(xì)胞的線粒體呼吸控制率【respiratory control ratio，RCR)，Erlotinib(10μM)可降低Ⅳ態(tài)呼吸。4)Erloti

11、nib作用30min呈濃度依賴性促進(jìn)A549細(xì)胞O2-的產(chǎn)生并增加A549細(xì)胞NADPH氧化酶催化亞基gp91的mRNA水平。5)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)(1mM)可抑制Eflotinib(10μM)降低細(xì)胞活力的作用。6)Erlotinib作用24h呈濃度依賴性降低A549細(xì)胞的△ψm，并促進(jìn)A549細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C和AIF的釋放。7)Erlotinib作用24h呈濃度依賴性促進(jìn)

12、A549細(xì)胞JNK的磷酸化。 結(jié)論：Erlotinib可通過增加ROS的產(chǎn)生，活化JNK，激活線粒體凋亡通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。 本文研究工作表明喹唑啉類化合物經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)后，可形成活性較高的新化合物。它們不僅能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且對(duì)TK活性有較強(qiáng)的抑制作用。Erlotinib能促進(jìn)A549細(xì)胞ROS的生成，激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)線粒體途徑的凋亡，該新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為將喹唑啉類化合物發(fā)展為更有效的抗腫瘤藥物積累了必要的學(xué)術(shù)與實(shí)