利用孕婦外周血中胎兒有核紅細胞無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷染色體非整倍體異常.pdf

1、第一部分 利用胎兒血紅蛋白表型顯微操作分選母血中胎兒有核紅細胞 目的建立高純度、高特異性的細胞分選技術(shù)，富集純化母血中胎兒有核紅細胞(fetalnucleatedredbloodcells，F(xiàn)NRBC)并探索最佳分選時機。方法188例孕婦外周血，經(jīng)密度梯度離心初步富集后行血紅蛋白γ鏈(gammachainofheamoglobin，γ-Hb)免疫組化染色，以顯微操作技術(shù)挑取陽性細胞。采用單細胞引物延伸預(yù)擴增(primer

2、extensionpreamplification，PEP)及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)檢測Y染色體特異性片段SRY基因。結(jié)果胎兒有核紅細胞具有鮮明的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)特征。188例母血中每例檢測0.6×108個有核細胞，186例可檢出FNRBC，數(shù)目為5～89個。正常妊娠孕婦共160例，早、中、晚孕FNRBC的數(shù)目分別為10.44±3.19，29.96±4.10，22.00±3.55，三組之

3、間具有極顯著差異(P＜0.01)，以中孕組最高。胎兒生長受限(fetalgrowthrestriction，F(xiàn)GR)妊娠18例，母血中FNRBC數(shù)均顯著高于同孕期正常妊娠組(P＜0.01)。Down綜合征胎兒及Turner綜合征胎兒各1例，分別檢出胎兒有核紅細胞89、43個，顯著高于同孕齡正常均值。對胎兒NRBC進行SRY基因的PEP-PCR檢測，男胎檢出率為95.74％(90/94)，女胎未檢出率為100％(92/92)，判斷胎兒性別

4、的準確率為97.85％(182/186)。結(jié)論以血紅蛋白γ鏈為分選標志，結(jié)合顯微操作技術(shù)，可以有效獲取高純度、高濃度研究模板，為后繼準確、特異的細胞來源鑒定及基因分析奠定基礎(chǔ)。中孕時母血中FNRBC數(shù)目最高，胎兒染色體非整倍體異常妊娠FNRBC升高，可為進一步的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供依據(jù)和指導(dǎo)。 第二部分 應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定母血中胎兒有核紅細胞 目的:探索X染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat

5、s，STR)位點在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中用于胎兒細胞鑒定、性別判斷等的可行性。方法47對孕婦及其配偶外周血，以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細胞，經(jīng)PEP擴增細胞基因組后，對2個X染色體STR位點DXS101、DXS6797及AMXY(XandYamelogeninalleles)基因進行PCR擴增。同時對各對夫妻外周血DNA進行上述基因位點擴增，聚丙烯酰胺及瓊脂糖電泳后胎兒樣本及其雙親的基因型對比分析判斷胎兒性別及NR

6、BC來源。結(jié)果3例擴增失敗，其他44例聯(lián)用DXS101、DXS6797及AMXY基因診斷女胎、男胎的靈敏度分別為90％(18/20)、91.67％(22/24)，胎兒性別診斷符合率為90.91％(40/44)。結(jié)論采用多個X-STR位點及AMXY基因擴增作為母血中胎源細胞鑒定系統(tǒng)，不局限于男胎，可準確鑒定細胞來源并判斷胎兒性別，而且快速、價廉，具有廣闊的發(fā)展前景。 第三部分 利用母血中胎兒有核紅細胞產(chǎn)前診斷染色體非整倍體

7、異常 試驗一母血中胎兒有核紅細胞熒光原位雜交診斷染色體非整倍體異常 目的:探討利用孕婦外周血中胎兒有核紅細胞進行染色體非整倍體異常的產(chǎn)前診斷的可行性。方法根據(jù)B型超聲及孕中期AFP、uE3、β-HCG三聯(lián)血清學(xué)檢測，從進行遺傳咨詢的114例孕婦中篩選出高危孕婦，另有1例產(chǎn)婦，因新生兒為Down綜合征(Downsyndrome，DS)兒于產(chǎn)后6天采集母血。以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細胞，采用CE

8、PX/Y及LSI21探針對孕產(chǎn)婦血樣中的胎兒FNRBC進行熒光原位雜交分析。結(jié)果共篩選出高危孕婦34例，分娩DS兒產(chǎn)婦1例，共16例接受母血中胎兒NRBC的熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)分析。FISH結(jié)果示Down綜合征兒2例，Turner綜合征兒2例，男胎8例，女胎8例。除1例診為Turner綜合征胎兒的實際核型為正常二倍體男性外，其余15例FISH結(jié)果均與實際核型一致，診斷符

9、合率為93.75％(15/16)。結(jié)論利用母血中胎兒有核紅細胞進行熒光原位雜交可成功診斷胎兒非整倍體異常，在國內(nèi)尚屬首例，并為該無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)走向臨床應(yīng)用奠定了實踐基礎(chǔ)。 試驗二短串聯(lián)重復(fù)序列用于染色體非整倍體異常的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 目的:探索短串聯(lián)重復(fù)序列用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21號染色體及性染色體非整倍體異常的可行性。方法進行遺傳咨詢的孕產(chǎn)婦及其配偶共50對，其中產(chǎn)婦及配偶1對，其余為孕婦及配偶。以血紅蛋白γ鏈染色結(jié)合

10、顯微操作分離獲取母血中胎兒有核紅細胞，經(jīng)PEP擴增細胞基因組后，對3個21染色體位點D21S11、D21S1411、D21S1412，2個X染色體STR位點DXS101、DXS6797及AMXY基因進行PCR擴增。同時對各對夫妻外周血DNA進行上述基因位點擴增，聚丙烯酰胺及瓊脂糖電泳后胎兒及其雙親的基因型對比分析。結(jié)果50例胎兒細胞樣本有3例擴增失敗。其余47例D21S11、D21S1411及D21S1412位點的有效信息率分別為85.

11、11％(40/47)、78.72％(37/47)、76.60％(36/47)。3個STR位點聯(lián)合應(yīng)用，對45例樣本成功鑒定了細胞的胎兒源性并準確判斷胎兒21號染色體的數(shù)目，符合率為95.74％(45/47)。檢出2例Down綜合征兒，與其實際核型相符。DXS101+DXS6797+AMXY基因診斷女胎、男胎的靈敏度分別為90.48％(19/21)、92.31％(24/26)，胎兒性別診斷符合率為91.49％(43/47)。同時成功診斷1